薯蕷素抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的機制研究*

李明，趙卿，高峰

(1.湖南省長沙市口腔醫(yī)院,湖南 長沙 410004；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 超聲科,湖南 長沙 410013)

口腔癌是世界第6大致死性惡性腫瘤，其中約90%為口腔鱗狀細(xì)胞癌，近年來口腔癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢。來自流行病學(xué)及臨床與基礎(chǔ)研究的多方證據(jù)表明，口腔鱗狀細(xì)胞癌與長期的化學(xué)致癌物（如煙草中的尼古丁、焦油、酒精），物理致畸變因素暴露，及病毒感染（人乳頭狀瘤病毒）等密切相關(guān)。由于口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機制復(fù)雜，目前仍沒有特定的分子靶向藥物應(yīng)用于臨床。手術(shù)切除，結(jié)合局部放療和化療仍是口腔鱗狀細(xì)胞癌的主要治療手段。由于口腔鱗狀細(xì)胞癌具有極易早期轉(zhuǎn)移的臨床特征，口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的5年生存率仍不足50%[1-3]。因此，闡明口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機制，尋找有效的藥物靶點或研發(fā)新型抗腫瘤藥物仍是目前研究的熱點。

小分子化合物由于其特有的低毒副作用，多年來備受抗腫瘤藥物篩選及研發(fā)的青睞。天然產(chǎn)物薯蕷素已被證實具有廣譜的體內(nèi)外抗腫瘤活性。薯蕷素可以通過抑制多條蛋白激酶信號通路及多個轉(zhuǎn)錄因子的功能，阻斷腫瘤賴以生存與生長的重要生物大分子的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]。但薯蕷素抗口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子機制及其潛在靶點還不清楚。本研究以人口腔鱗狀細(xì)胞癌TSCCa和TCA8113為研究模型，探討薯蕷素對其增殖存活的抑制作用及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

實驗用人口腔鱗狀癌細(xì)胞TSCCa和TCa8113購自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.1 主要試劑和抗體

薯蕷素（Dioscin，純度＞97%）購自美國Selleck公司，分子量869.04 g/mol。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Gibco公司 ,免疫印跡抗體 [包括 HK2（#2867）、PFK（#8164）、PKM2（#4053）、PARP（#9532）和 Cleaved-Caspase3（#9664）]購自美國Cell Signaling Technology公司，Glut1（ab15309）購自美國Abcam公司，β-actin（A5316）抗體購自美國Sigma公司，MTS試劑Cell Titer 96? AQueous One Solution購買自美國Promega公司，F(xiàn)lag-HK2過表達(dá)質(zhì)粒購自美國Origene公司。

1.2 MTS實驗和軟瓊脂集落形成實驗檢測薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖的影響

將TSCCa和TCa8113細(xì)胞消化計數(shù)后，按照3 000個/（孔·100 μl）密度接種于96孔板。24 h后，更換含有不同濃度薯蕷素的新鮮培基至96孔板中，在薯蕷素處理后的不同時間點（24、48及72 h）加入20 μl的MTS試劑至96孔板中，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）檢測490 nm處吸光度值。

將配制好的2×BME培養(yǎng)基和1.25%瓊脂凝膠放置48℃水浴鍋中保溫備用。取70 ml預(yù)熱的2×BME，18 ml 1×PBS，18 ml FBS，2 ml L-Glutamine，100 μl Gentamicin以及72 ml 1.25%瓊脂凝膠混勻后即為下層瓊脂凝膠混合液，放置48℃水浴鍋保溫備用。將不同濃度的薯蕷素和下層瓊脂凝膠混勻后3 ml/孔迅速加入6孔板中，并放置在超凈臺充分凝固。將TSCCa和TCa8113細(xì)胞消化計數(shù)后，用1×BME稀釋成30 000個/ml細(xì)胞懸液。取2.4 ml下層凝膠并與1.2 ml細(xì)胞懸液及不同濃度的薯蕷素混勻后，1 ml/孔加入含有下層凝膠的6孔板中，待瓊脂凝膠完全凝固后，將6孔板放置培養(yǎng)箱中孵育2周，顯微鏡拍照并統(tǒng)計克隆數(shù)。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌糖酵解調(diào)控蛋白及凋亡調(diào)控分子表達(dá)的影響

離心收集薯蕷素處理24 h后的TSCCa和TCa8113細(xì)胞，加入300 μl RIPA（25 mmol/L Tris.HCl pH 7.6,150 mmol/L NaCl, 1% NP-40，1% sodium deoxycholate）細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，超聲粉碎15 s，13 000 r/min離心15 min，上清即為全細(xì)胞裂解液。用BCA試劑盒定量蛋白濃度，取30 μg蛋白進行免疫印跡分析。蛋白在SDS-PAGE電泳中分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉過夜。次日加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min。X射線曝光、顯影、定影。

1.4 葡萄糖攝取及乳酸生成效率檢測

取1×106個細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)箱孵育6 h后，更換含有不同濃度薯蕷素的新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)8 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，全自動臨床生化檢測儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)葡萄糖和乳酸濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，不同時間點和組間的比較采用方差分析或t檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖的影響

MTS結(jié)果顯示1 μmol/L薯蕷素處理細(xì)胞24 h并不能抑制TSCCa和TCa8113細(xì)胞的生長。薯蕷素對TSCCa和TCa8113細(xì)胞72 h的IC50值分別為3.65和3.02 μmol/L。隨著時間延長，1 μmol/L薯蕷素處理72 h后能抑制這2株細(xì)胞的增殖。隨著薯蕷素濃度升高，在24 h時 5 μmol/L薯蕷素即開始抑制TSCCa（F=1.518，P=0.00042）和TCa8113細(xì)胞的增殖（F=1.518和1.777，P=0.00042和0.00032），72 h時，5 μmol/L薯蕷素對細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)到80%，薯蕷素處理組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

為進一步證實薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌的抑制作用，筆者采用軟瓊脂克隆形成實驗檢測薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌克隆形成能力的影響。與MTS結(jié)果一致的是，薯蕷素呈劑量依賴性抑制TSCCa和TCa8113細(xì)胞克隆的形成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.094和21.341，均P=0.000）。5 μmol/L薯蕷素幾乎完全阻斷這2株細(xì)胞的克隆形成（P＜0.05）。見圖2。

圖1 薯蕷素對TSCCa和TCa8113細(xì)胞增殖的影響

圖2 薯蕷素對細(xì)胞停泊非依賴生長的影響

2.2 薯蕷素對有氧糖酵解的影響

對薯蕷素處理前后口腔鱗狀細(xì)胞癌葡萄糖攝取能力的檢測發(fā)現(xiàn)，薯蕷素抑制TSCCa和TCa8113細(xì)胞對葡萄糖的攝取，該抑制作用具有劑量依賴性。與對照組比較，5 μmol/L薯蕷素下調(diào)了TSCCa細(xì)胞65%和TCA8113細(xì)胞75%的葡萄糖攝取效率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.866和3.874，P=0.001和0.000）。且這2株細(xì)胞的乳酸生成也下調(diào)。5 μmol/L薯蕷素抑制TSCCa細(xì)胞近50%和TCa8113近70%的乳酸生成量，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.246和2.234，均P=0.000）。見圖 3。

薯蕷素劑量依賴性抑制TSCCa和TCa8113細(xì)胞內(nèi)ATP水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.987和2.194，P=0.001和0.000）。見圖4。

2.3 薯蕷素對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1和己糖激酶HK2表達(dá)的影響

薯蕷素抑制Glut1和HK2蛋白的表達(dá)，并不能抑制PFK和PKM2蛋白的表達(dá)。見圖5。

2.4 薯蕷素對凋亡相關(guān)分子活化的影響

圖3 薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌糖酵解的影響

圖4 薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌ATP水平的影響

圖5 薯蕷素對Glut1和HK2表達(dá)的影響

免疫印跡結(jié)果表明，薯蕷素抑制HK2表達(dá)的同時，促進凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切活化。低濃度薯蕷素只能輕微抑制HK2的表達(dá)，Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切體活化并不明顯。隨著濃度升高，5 μmol/L薯蕷素能促進Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切體表達(dá)。見圖6。

2.5 過表達(dá)HK2對薯蕷素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

圖6 薯蕷素對口腔鱗狀細(xì)胞癌PARP、Caspase-9和Caspase-3剪切體形成的影響

圖7 過表達(dá)HK2對薯蕷素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

與前期結(jié)果一致的是，2 μmol/L薯蕷素能促進Caspase-3和PARP剪切體的表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)HK2后，能抑制薯蕷素誘導(dǎo)的Caspase-3和PARP剪切體表達(dá)。見圖7。

3 討論

有氧糖酵解異常是腫瘤細(xì)胞重要生物學(xué)特征之一。研究發(fā)現(xiàn)，即使在供氧充足的情況下，腫瘤細(xì)胞仍傾向于利用有氧糖酵解的方式將葡萄糖分子不完全氧化生產(chǎn)乳酸來為細(xì)胞供能，該現(xiàn)象被稱為“溫伯格效應(yīng)”[7]。有氧糖酵解不僅能為腫瘤細(xì)胞提供充足的能量供給，其葡萄糖不完全氧化所生產(chǎn)的中間產(chǎn)物更為快速增殖的腫瘤細(xì)胞提供了生物大分子合成所必需的原料。己糖激酶HK2作為催化葡萄糖向葡萄糖6磷酸轉(zhuǎn)化的蛋白激酶，也是糖酵解過程中第一個限速酶。目前共發(fā)現(xiàn)4種己糖激酶亞型，包括HK1、HK2、HK3和HK4，但只有HK2被證明在多種人腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)[8]。HK2已被證實在人肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌等多種腫瘤內(nèi)高表達(dá)，HK2過表達(dá)不僅滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖而對能量的需求，更促進腫瘤細(xì)胞的放化療耐受及死亡逃逸，腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)HK2提示著預(yù)后不良[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物薯蕷素能抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌TSCCa和TCa8113細(xì)胞的增殖及克隆形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷素對TSCCa和TCa8113細(xì)胞的抑制作用與其下調(diào)腫瘤細(xì)胞的糖酵解及HK2的表達(dá)有關(guān)。雖然薯蕷素在胞內(nèi)具有多個潛在的分子靶點，如抑制腫瘤相關(guān)蛋白激酶的活化，下調(diào)腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的入核等，但薯蕷素對腫瘤細(xì)胞代謝的影響還未見研究報道。本研究首次證實，薯蕷素可以通過下調(diào)HK2表達(dá)及有氧糖酵解而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌。該結(jié)果提示，靶向抑制HK2的表達(dá)/活性，或抑制HK2介導(dǎo)的有氧糖酵解可能為口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療提供新的藥物作用靶點或開創(chuàng)新的腫瘤診療手段。

研究表明，HK2作為線粒體外膜表達(dá)蛋白，在控制線粒體電勢穩(wěn)定性和細(xì)胞凋亡方面具有重要的生物學(xué)功能[11]。異常高表達(dá)HK2促進腫瘤細(xì)胞對不良環(huán)境因素的抵抗及細(xì)胞死亡信號的相對不敏感。共同靶向HK2介導(dǎo)的有氧糖酵解和細(xì)胞自噬促進前列腺癌細(xì)胞的死亡[12]。HK2在線粒體外膜通過與電壓依賴性陰離子通道VDAC相互結(jié)合而穩(wěn)定線粒體電勢。抑制HK2的線粒體表達(dá)能有效促進非小細(xì)胞性肺癌的凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷素下調(diào)HK2的表達(dá)，并誘導(dǎo)TSCCa和Tca8113細(xì)胞的凋亡。進一步研究表明，薯蕷素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是HK2表達(dá)下調(diào)依賴的，過表達(dá)HK2有效抑制薯蕷素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本結(jié)果提示，HK2對促進口腔鱗狀細(xì)胞癌的存活具有重要的作用，薯蕷素誘導(dǎo)的口腔鱗狀癌細(xì)胞死亡是否與HK2表達(dá)下調(diào)而導(dǎo)致的線粒體電勢紊亂有關(guān)還有待進一步研究證實。

靶向抑制有氧糖酵解或糖酵解的關(guān)鍵限速酶對促進腫瘤細(xì)胞的死亡或放化療增敏具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種天然產(chǎn)物可以通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)HK2的表達(dá)及下調(diào)有氧糖酵解而發(fā)揮其抗腫瘤功能。如白藜蘆醇、魚藤素通過抑制HK2而促進非小細(xì)胞性肺癌凋亡等[13-14]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能抑制HK2的表達(dá)并促進口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[15]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示HK2高表達(dá)或上調(diào)有氧糖酵解可能對口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。本研究不僅豐富了小分子化合物薯蕷素抗腫瘤的新機制，更為靶向抑制HK2或有氧糖酵解的口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床治療提供了前期的研究基礎(chǔ)。