豬脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)的研究現(xiàn)狀

邵 彬，焦海燕，李前勇，葛良鵬

(1.如東縣河口畜牧獸醫(yī)站，江蘇 南通 226463； 2.西南大學(xué)，重慶 402460； 3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

動(dòng)物組織經(jīng)過(guò)剝離獲取有用部分，再經(jīng)過(guò)除脂、除細(xì)胞、除抗原等后制作成的生物材料，統(tǒng)稱為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。豬脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)(urinary bladder matrix，UBM)屬于細(xì)胞外基質(zhì)中的一種。20世紀(jì)90年代開(kāi)始有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[1]UBM具有無(wú)侵蝕性、組織相容性好、能誘導(dǎo)組織再生、形成瘢痕少等優(yōu)點(diǎn)，且還能誘導(dǎo)血液中游離的多種成體干細(xì)胞[1]向植入部位富集，并分化為神經(jīng)、血管、平滑肌[2]、心肌、鼓膜、肌腱以及氣管等多種有效組織，從而達(dá)到組織修復(fù)的目的，是盆底高分子補(bǔ)片的理想替代材料。相較于其他脫細(xì)胞基質(zhì)材料，UBM在器官損傷修復(fù)過(guò)程中，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移的作用。同時(shí)，UBM在經(jīng)分層、脫細(xì)胞、消毒及凍干等處理后比其他ECM材料在結(jié)構(gòu)上更易保留完整的基底層[3]，對(duì)參與組織修復(fù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)有獨(dú)特的較強(qiáng)親和力和粘附力[4]。

1 UBM的結(jié)構(gòu)與功能

有形態(tài)學(xué)的證據(jù)表明，來(lái)源于不同器官的生物支架材料都有自己特有的三維結(jié)構(gòu)，如UBM，其顯微和超微結(jié)構(gòu)有特征性的矩陣，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為、控制細(xì)胞遷移到支架的能力和影響組織特定的細(xì)胞表型上扮演了重要作用[5]。一個(gè)完整的基底膜可以很大程度防止體外細(xì)胞滲透到基礎(chǔ)矩陣，不規(guī)則的纖維表面結(jié)構(gòu)可以在不同細(xì)胞類型的選擇和細(xì)胞滲透到支架材料方面發(fā)揮促進(jìn)作用。UBM還可以顯著影響人類胚胎干細(xì)胞的分化途徑和祖細(xì)胞數(shù)量的選擇[6]。

UBM支架的膠原纖維結(jié)構(gòu)在其生物力學(xué)上扮演著關(guān)鍵的角色。膠原纖維拉直后有典型的褶模式，并且可以向旋轉(zhuǎn)的方向延伸。組織膠原纖維隨力的旋轉(zhuǎn)是可逆的，直到達(dá)到UBM所能承受的最大應(yīng)變量，膠原纖維的空間排列變化可以使用簡(jiǎn)單的仿射模型進(jìn)行預(yù)測(cè)[7]。但隨著外力的不斷增大，空間結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)變化就是永久性的，不能再用仿射模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，這樣就會(huì)導(dǎo)致UBM支架整體生物力學(xué)行為的變化。

不同的ECM是由不同器官內(nèi)的組織所分泌，它們具有不同的結(jié)構(gòu)、功能和組成分子。因此，不同ECM的物質(zhì)組成和分布取決于它的組織來(lái)源。UBM具有生物支架材料的廣泛特性，目前被用作典型的生物支架材料。UBM的干重有超過(guò)90%的是膠原蛋白，有少量的III、IV、V和VI膠原蛋白，絕大多數(shù)是I型膠原蛋白；此外，它還含各種各樣的葡糖氨基和葡聚糖等有機(jī)物，包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等。目前的研究證明UBM也含有各種生長(zhǎng)因子，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)[8]。其中，一些生長(zhǎng)因子在體內(nèi)可以保持其生物活性，即使終端滅菌后其生物活性也會(huì)長(zhǎng)期存在?？傊?，細(xì)胞外基質(zhì)和多種多樣的復(fù)雜分子組成的生物支架材料植入組織和器官后，可以給修復(fù)和重建所需的細(xì)胞以更好的支持并發(fā)揮功能。

2 UBM的制備方法

豬膀胱需要經(jīng)過(guò)幾個(gè)處理步驟才能制備成UBM支架材料，這幾個(gè)處理步驟可以顯著影響材料的結(jié)構(gòu)、對(duì)宿主的反應(yīng)類型和修復(fù)重建組織的能力。UBM支架材料需要通過(guò)使用物理的機(jī)械方法去除多余的組織結(jié)構(gòu)如粘膜層、漿膜層和肌層，再經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞等步驟，放入冷凍真空干燥機(jī)凍干和終末消毒，最后制成UBM。每一個(gè)處理步驟都可以改變UBM生物支架材料的結(jié)構(gòu)完整性和架構(gòu)，這些改變都會(huì)影響UBM的機(jī)械和材料性能。

2.1 去細(xì)胞

來(lái)源于同種異體或異種動(dòng)物組織的ECM支架材料都含有細(xì)胞，其細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的組件具有抗原表位，有效的清除這些抗原表位可以減少或避免植入組織或器官的不良免疫反應(yīng)。異種或同種異體的細(xì)胞抗原是導(dǎo)致植入組織或器官不良炎癥反應(yīng)和明顯免疫介導(dǎo)排斥的主要原因[9-11]。但某些抗原因含量少和分布不集中很少發(fā)生不良免疫反應(yīng)，如豬UBM上的3-半乳糖，并不能激活補(bǔ)體或綁定IgM抗體[12]。使用適合的方法去細(xì)胞，最終目標(biāo)是清除UBM生物支架材料上所有的細(xì)胞成分，且不能破壞UBM的機(jī)械完整性和一系列的生物活性。去細(xì)胞的常用方法包括物理法、化學(xué)法及物理化學(xué)相結(jié)合法幾種。聲波降解、攪拌和凍融可用來(lái)破壞細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞內(nèi)容物和促進(jìn)清除UBM上的細(xì)胞殘余。常用的去細(xì)胞的方法并不足以實(shí)現(xiàn)完整去除UBM上的細(xì)胞，這樣，UBM支架材料上會(huì)保留一些DNA[13]。雖然從理論上講這些方法去細(xì)胞會(huì)影響到UBM的結(jié)構(gòu)和組成，但也能保護(hù)UBM本身所具有的優(yōu)秀機(jī)械性能和良好的生物性能。研究發(fā)現(xiàn)，一些促進(jìn)去細(xì)胞的化學(xué)試劑能破壞某些組織的膠原蛋白，從而降低組織的機(jī)械強(qiáng)度，但對(duì)其他組織的膠原蛋白無(wú)影響[14]。因此，UBM的去細(xì)胞方法需要不斷研究與優(yōu)化，探索和發(fā)展出更多的UBM機(jī)械和生物性能影響最小的方法。

2.2 水合作用

UBM生物支架材料在整個(gè)去細(xì)胞和滅菌過(guò)程中保持水合狀態(tài)，材料內(nèi)的離子和水分子發(fā)生靜電作用，這種靜電作用使離子與水分子以離子對(duì)的形式存在，可以防止組織架構(gòu)的變化，如膠原纖維與各種分子之間形成的物理聯(lián)系。然而，UBM在水合狀態(tài)下處理的主要缺點(diǎn)是會(huì)有可溶性的生長(zhǎng)因子如VEGF和bFGF等的連續(xù)浸出，導(dǎo)致材料的壽命和生物性能降低。所以在目前的技術(shù)手段下還難以防止這些生長(zhǎng)因子的丟失，希望以后通過(guò)技術(shù)的革新進(jìn)步解決這一問(wèn)題，更大限度的保留其性能。

2.3 脫水

UBM生物支架材料通常使用冷凍真空干燥的方法脫水，脫水后使得支架更容易處理并能限制生長(zhǎng)因子的向外流失。凍干過(guò)程中，水在低溫和低壓力狀態(tài)下從UBM上升華出去。冷凍真空干燥法可以保護(hù)UBM的機(jī)械和生物性能，并且可以使UBM長(zhǎng)期儲(chǔ)存。但冷凍真空干燥法雖可以延長(zhǎng)UBM保質(zhì)期，卻對(duì)材料的強(qiáng)度值無(wú)影響，也會(huì)改變膠原纖維形態(tài)[15]。冷凍真空干燥法可以顯著減少UBM的厚度，使纖維形態(tài)更為致密。脫水還可以使UBM的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，繼而影響其在植入體內(nèi)后的細(xì)胞附著、降解速率和細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的能力[16]。

2.4 終端滅菌

研究表明，終端滅菌可以對(duì)UBM支架的機(jī)械性造成不利的影響[17]。UBM暴露于環(huán)氧乙烷、γ輻照(20 kGy)和電子束輻照(22 kGy)時(shí)會(huì)降低單軸和雙軸的機(jī)械性能[17]。但在低劑量的γ輻照(< 15 kGy)后，UBM的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)有所增加[18-19]。這些變化與膠原蛋白鏈的斷開(kāi)有關(guān)，隨著輻照劑量增加，膠原蛋白鏈斷開(kāi)增加，繼而其機(jī)械強(qiáng)度會(huì)下降。一般對(duì)UBM采用γ輻照(25 kGy)進(jìn)行終端滅菌。

3 UBM的應(yīng)用

3.1 粉狀UBM支架

凍干的UBM可以粉碎成粉末或顆粒形式[20]。粉末形式的UBM支架可以通過(guò)微創(chuàng)技術(shù)(如針注射)注入患部制造成三維支架。UBM在粉碎后仍保留原本的超微結(jié)構(gòu)和三維表面特征表。凍干UBM粉末制成的懸浮液已經(jīng)成功地用作注射支架在臨床治療尿失禁[21]。粉末形式的UBM生物支架材料也可以用于局部組織損傷或與其他物質(zhì)制成混合支架用于臨床治療。由于粉末形式的UBM提供承載能力很有限，所以使用時(shí)需考慮粉末顆粒的大小、患部面積等，這樣才能更有效的治療和修復(fù)受損的組織。

3.2 凝膠狀的UBM支架

凝膠狀的UBM生物支架材料可以在適當(dāng)時(shí)候充當(dāng)細(xì)胞運(yùn)載工具，進(jìn)而擴(kuò)大其臨床應(yīng)用的范圍和增加治療效果。根據(jù)凝膠的流變特性可以設(shè)計(jì)成類似的組織進(jìn)行治療。凝膠形式的UBM可以保持生長(zhǎng)因子的活性進(jìn)而使其具有與普通UBM相同的生物活性。早期的研究已經(jīng)表明，凝膠形式的UBM能夠支持多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和在體外的分化，如肌母細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等[22]。

3.3 UBM組成的混合支架

UBM生物支架材料受組織本身特性的影響，包括形狀、機(jī)械性能等。UBM生物支架材料性能也受制造過(guò)程(即機(jī)械去細(xì)胞和化學(xué)去細(xì)胞)和動(dòng)物的年齡與健康狀況的影響。但可以通過(guò)一些物理的方法對(duì)UBM進(jìn)行操縱來(lái)改變它的機(jī)械性能。例如，可以通過(guò)增加UBM的層數(shù)來(lái)增加薄板形UBM的最大承受力[23-24]。

人工合成支架材料具有穩(wěn)定和可重復(fù)再生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，然而，人工合成材料缺乏生物活性不能快速幫助受損組織重建，也不能在體內(nèi)根據(jù)需要降解。結(jié)合UBM與人工合成材料的優(yōu)點(diǎn)，即機(jī)械性能和生物性能，制作成混合材料，例如結(jié)合UBM與聚尿素可創(chuàng)建彈性混合支架材料剛度、強(qiáng)度都有所增加，且當(dāng)入體內(nèi)時(shí)，混合支架材料的降解速度比天然的UBM慢[25]。

3.4 UBM的修飾

在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，天然的ECM植入人體后降解過(guò)快，易吸水膨脹，受熱會(huì)變形，承受器官擠壓和牽拉的能力有限，使用一段時(shí)間后就不能繼續(xù)承受牽拉器官的重力，從而導(dǎo)致器官再次回到錯(cuò)誤的部位，使得疾病復(fù)發(fā)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)天然UBM通過(guò)與交聯(lián)劑交聯(lián)后再使用，很多性質(zhì)得到了優(yōu)化，如可以使熱穩(wěn)定性提高，水洗后形態(tài)基本會(huì)保持穩(wěn)定，抗酶解的能力提升，抗拉力和沖擊力的能力也大幅提高，機(jī)械性能增強(qiáng)。對(duì)細(xì)胞的識(shí)別能力也有所提升，能夠使細(xì)胞更加牢固的附著和適應(yīng)生物材料，能改善植入部位組織的炎癥反應(yīng)和異物反應(yīng)[26-27]。

在UBM修飾過(guò)程中所使用的交聯(lián)劑，應(yīng)是低免疫原性、低毒、低抗原性，對(duì)人體有較好的生物相容性，并且能夠引導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和分化。目前使用的交聯(lián)劑有多巴胺、碳化二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛、京尼平等。研究發(fā)現(xiàn)EDC/NHS交聯(lián)的材料有較高的交聯(lián)度，幾乎對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，有良好的生物相容性和良好的細(xì)胞相容性[26, 28]。經(jīng)京尼平交聯(lián)的材料抗酶解能力最強(qiáng)，具有較好的吸水能力，可有效的促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)真皮的生成并且可有效控制[29]。經(jīng)戊二醛交聯(lián)的材料對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，但抵抗傷口收縮的能力較強(qiáng)，能夠誘導(dǎo)傷口附近的新生組織向著傷口內(nèi)部生長(zhǎng)[30]。

交聯(lián)可以減少UBM支架在體內(nèi)降解的速率，早期的研究發(fā)現(xiàn)海洋貽貝分泌的黏附蛋白在水的參與下可以使貽貝緊密附著在海洋固體物質(zhì)上，這種黏附蛋白含有3,4-二羥基苯丙胺序列，多巴胺有類似的結(jié)構(gòu)序列，這就為科學(xué)家們提供一個(gè)新的平臺(tái)用以改造生物材料的性能[31]。有研究報(bào)道稱多巴胺(dopamine)可以在水溶液里發(fā)生氧化-交聯(lián)反應(yīng)，使生物材料的表面形成一層強(qiáng)力黏附性的聚多巴胺復(fù)合膜。在水溶液里多巴胺的鄰苯二酚基團(tuán)可以發(fā)生氧化反應(yīng)，形成多巴胺醌化合物，此化合物含有鄰苯二醌結(jié)構(gòu)。多巴胺醌化合物與多巴胺可以發(fā)生反歧化反應(yīng)，生成半醌自由基，之后繼續(xù)反應(yīng)生成交聯(lián)鍵，同時(shí)可以在固體材料的表面生成一層強(qiáng)力黏附性的復(fù)合膜[32-33]。有研究報(bào)道表明，多巴胺強(qiáng)力粘附在固體材料表面上的機(jī)理是源于多巴胺的氨基官能團(tuán)和鄰苯二酚，這種結(jié)構(gòu)可以和材料表面發(fā)生非共價(jià)和共價(jià)的相互作用，繼而可以使聚多巴胺復(fù)合膜緊密粘附在固體材料的表面上[34-36]。已有研究結(jié)果表明，聚多巴胺復(fù)合膜表面含有非常多的官能團(tuán)，它們可以與有些生物分子和含有氨基、氫硫基等官能基團(tuán)的聚合物發(fā)生反應(yīng)，對(duì)固體材料進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，提高固體材料的性能[34-36]。

近幾年來(lái)，在器官發(fā)育領(lǐng)域的多項(xiàng)研究報(bào)道初步揭示了層粘連蛋白(laminin)的干細(xì)胞富集機(jī)制：層粘連蛋白通過(guò)其LG功能域與干細(xì)胞特有受體亞型——integrinα6β1結(jié)合，能使胚胎干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞等多種成體干細(xì)胞[37-40]向其趨化并粘附。巢蛋白(nidogen)結(jié)合于層粘連蛋白的γ1-LEb3域，對(duì)層粘連蛋白的功能存在重要的調(diào)控機(jī)制。以神經(jīng)干細(xì)胞為研究對(duì)象的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)當(dāng)上調(diào)巢蛋白的表達(dá)后，會(huì)通過(guò)激活Notch1通路促進(jìn)干細(xì)胞向?qū)诱尺B蛋白趨化和粘附，并抑制干細(xì)胞的分化，這種功能可被通過(guò)干擾層粘連蛋白的γ鏈與巢蛋白的結(jié)合而阻斷[41]；并且巢蛋白對(duì)于層粘連蛋白分子彼此間的連接具有重要作用。所以可以在UBM上添加層粘連蛋白/巢蛋白，這兩種蛋白相互作用增強(qiáng)它們的自身功能，這樣就有助于提高UBM材料的生物性能，也有助于提高材料的力學(xué)性能，使UBM材料植入組織后能夠吸引更多的干細(xì)胞聚集和分化，在器官位置變動(dòng)時(shí)可以有效的限位保證器官正常的工作，利用這兩種蛋白的生物功能加速修復(fù)受損的組織和器官，受損組織和器官能夠很快的恢復(fù)正常的狀態(tài)，保障人體的健康，所以選擇這兩種蛋白修飾UBM是明智的。

3.5 UBM的細(xì)胞種植

應(yīng)用組織工程方法修復(fù)人體受損組織或器官時(shí)所用的各類功能細(xì)胞統(tǒng)稱為種子細(xì)胞。種子細(xì)胞有不同的類型，依據(jù)種子細(xì)胞是否來(lái)源自患者本身，可分為自體種子細(xì)胞和異體種子細(xì)胞；根據(jù)種子細(xì)胞的分化狀態(tài)又可分為分化成熟的成體細(xì)胞和具有分化潛能的干細(xì)胞，其中的干細(xì)胞又包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。種子細(xì)胞在植入人體后可以分化成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，可以彌補(bǔ)人體受損部位干細(xì)胞的不足，極大的促進(jìn)受損組織或器官的恢復(fù)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)可以把種子細(xì)胞接種到UBM上，種子細(xì)胞可以很好的附著在UBM上，當(dāng)把UBM植入人體受損的部位后，種子細(xì)胞可以以材料為平臺(tái)生長(zhǎng)繁殖分化，進(jìn)而修復(fù)受損的組織或器官。因生物材料本身攜帶很多種生長(zhǎng)因子，所以生物材料也促進(jìn)種子細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和分化，進(jìn)一步促進(jìn)受損組織或器官的修復(fù)。目前已應(yīng)用于皮膚更換和傷口修復(fù)、 多種類型的疝修補(bǔ)術(shù)[42]、腹壁移植、結(jié)腸和直腸手術(shù)、食道修復(fù)、尿失禁治療、膀胱擴(kuò)張與骨盆器官脫垂修復(fù)、硬腦膜的修復(fù)與軟組織修復(fù)等。

4 UBM的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

Gilbert等人[43]使用UBM制成生物材料補(bǔ)片用于修復(fù)氣管病損，研究表明UBM只適用于小范圍氣管損傷，不能用于長(zhǎng)形大范圍損傷修復(fù)。袁銘[44]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UBM可以大面積替代犬的損傷膀胱，并且有利于犬膀胱的重建。魏桂枝等[45]在UBM上添加層粘連蛋白有利于BMSCs的增殖和向平滑肌的分化，使大鼠的尿失禁癥狀得以改善也增加了在體內(nèi)的降解時(shí)間。楊鏵琦等[46]制作骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-豬脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)-聚丙烯復(fù)合網(wǎng)片，植入大鼠體內(nèi)后生物相容性好，只有輕微的炎癥反應(yīng)，張力提升，是治療骨盆腹腔脫垂的良好候選材料。目前UBM材料的使用僅限于試驗(yàn)階段，離臨床應(yīng)用還有一段距離，還有待廣大學(xué)者的進(jìn)一步研究。

5 展望

現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，豬脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)是一個(gè)優(yōu)秀的生物支架材料可適用于許多疾病的治療。成功使用UBM作為治療材料在很大程度上取決于我們理解原生UBM結(jié)構(gòu)與生物功能關(guān)系的能力。但植入人體后降解速度過(guò)快是其缺點(diǎn)。未來(lái)的研究方向是使用創(chuàng)新的思維和方法，使UBM的生物性能和力學(xué)性能都有所提高更有利于治療疾病。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物材料也在不斷地進(jìn)步，目前已經(jīng)不只是醫(yī)學(xué)而是依靠多學(xué)科的共同合作發(fā)展。加之道德倫理上的問(wèn)題沒(méi)有就解決所以克隆器官的應(yīng)用還不能開(kāi)展，目前生物材料依然是重要的人體組織替換或修補(bǔ)材料。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民對(duì)高精尖生物材料的需求也在不斷的增加，生物材料的發(fā)展具有非常光明的前景。