家畜精液冷凍保存的抗氧化研究進(jìn)展

王麗云，李艷華，王彥平，麻柱

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192）

1 氨基酸類

氨基酸是構(gòu)成動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。其中丙氨酸、半胱氨酸還具有抗氧化、抗菌、解毒等作用，在醫(yī)學(xué)上用作治療由于缺精、少精所致的男性不育癥。在國(guó)外已有將半胱氨酸用作牛冷凍精液營(yíng)養(yǎng)劑和保護(hù)劑的報(bào)道[1,2]，國(guó)內(nèi)胡傳活等將丙氨酸、半胱氨酸等氨基酸添加到牛冷凍稀釋液中取得一定的進(jìn)展[3]。

1.1 丙氨酸

丙氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，在生理代謝過(guò)程擔(dān)任著重要角色，作為多種活性物質(zhì)的中間代謝產(chǎn)物，有抗疲勞、抗衰老的作用。另外，丙氨酸還是某些生物抗凍蛋白的主要成分，而抗凍蛋白可以降低體液的冰點(diǎn)，減少冷凍過(guò)程中冰晶的生成[4～6]。正是由于丙氨酸具有以上生理機(jī)能，胡傳活等將丙氨酸添加到牛冷凍精液稀釋液中后發(fā)現(xiàn)冷凍后精液活力有一定提高[3]。但是國(guó)內(nèi)將丙氨酸作為抗氧化劑用于冷凍精液稀釋液的研究較少，需要更進(jìn)一步地研究加以論證。

1.2 半胱氨酸

半胱氨酸其巰基可以使蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定性，具有抗氧化作用，能夠在冷凍過(guò)程中保護(hù)精子質(zhì)膜免受氧化損傷[7]。Bilodeau等[1]在牛冷凍精液中加入0.5μmol/L半胱氨酸結(jié)果可以使精子活力提高。有研究表明，牛冷凍精液生產(chǎn)過(guò)程中添加2mmol/L半胱氨酸能有效保護(hù)線粒體和精子頂體完整性。胡傳活等[3]將半胱氨酸添加到牛冷凍精液稀釋液中，結(jié)果精子活力未有明顯提高，但精子畸形率顯著低于對(duì)照組。關(guān)于添加半胱氨酸的時(shí)機(jī)和劑量還需要進(jìn)一步探討。

2 維生素類

2.1 維生素E

維生素E又稱生育酚，是一種脂溶性維生素。維生素E對(duì)線粒體磷脂以及網(wǎng)狀組織磷脂等有很強(qiáng)的親和力，與細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)構(gòu)相結(jié)合，可阻止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生從而保護(hù)精子。它是一種非常有效的預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抗氧化劑。維生素E具有抗氧化作用，能維持精細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。趙憲林[8]研究發(fā)現(xiàn)，在秦川牛冷凍精液稀釋液中添加一定量維生素E可以提高精液中抗氧化酶（CAT,SOD等）的活性，并能夠提高精子活力和頂體完整率。另有許多研究也驗(yàn)證了這一結(jié)論[9,10]。

2.2 維生素C

維生素C又稱抗壞血酸，是水溶性維生素，具有強(qiáng)還原性，其抗氧化作用是通過(guò)直接消除ROS而產(chǎn)生的。權(quán)富生等[11]研究表明，在綿羊冷凍精液稀釋液中，添加一定濃度的維生素C有效提高了精液品質(zhì)。還有研究發(fā)現(xiàn)，維生素C能提高精清中抗氧化酶的活性，并且能顯著改善精液品質(zhì)[12]。

2.3 維生素B12

維生素B12又名鈷維生素，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一含有金屬元素鈷的維生素。其通過(guò)減少組織的耗氧量，從而達(dá)到提高機(jī)體對(duì)氧的耐受性的效果。趙憲林在牛冷凍精液中添加維生素B12，發(fā)現(xiàn)情期受胎率有明顯的提高[8]；張磊[13]也證實(shí)了這一點(diǎn)。姚桂東等[14]發(fā)現(xiàn)B族維生素能提高精子的受精能力。孫淑琴[15]發(fā)現(xiàn)添加維生素B12能顯著提高精子的活力和頂體完整率。有研究發(fā)現(xiàn)將維生素B12用于牛羊的冷凍精液可以提高凍后的精子活力[16,17]。

3 酶類

3.1 過(guò)氧化氫酶（CAT）

過(guò)氧化氫酶是一種抗氧化酶。它可以減弱或消除H2O2對(duì)細(xì)胞的毒害作用，即將H2O2分解成H2O和O2，是一種組成生物體內(nèi)防御體系的關(guān)鍵酶。過(guò)氧化氫酶廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物中，其酶促反應(yīng)為機(jī)體提供了抗氧化能力。研究表明，外源性過(guò)氧化氫酶的添加可阻止ROS的過(guò)氧化損傷?；裘粼诮q山羊冷凍精液稀釋液中添加過(guò)氧化氫酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍后精子活力、質(zhì)膜完整率等均有顯著提高[18]。

3.2 超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶能將氧離子轉(zhuǎn)變?yōu)槿醵拘訦2O2，而H2O2通過(guò)生物體內(nèi)過(guò)氧化氫酶的作用分解成水和氧，以發(fā)揮其抗氧化性。余波瀾等的研究表明精液中SOD的含量與精子的活力呈正相關(guān)[19]。程舸等研究發(fā)現(xiàn)低溫保存的牛精液中超氧化物歧化酶的活性明顯降低[20]，徐振軍等[21]對(duì)凍前和凍后小尾寒羊精液和精子中的SOD活性精細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)冷凍對(duì)SOD造成很大的損傷。因此在冷凍精液稀釋液中添加外源性的SOD，能保護(hù)精子免受過(guò)氧化損傷。劉超等[22]研究結(jié)果表明，山羊精液中添加SOD能有效提高精子的活力。

4 其他

4.1 谷胱甘肽（GSH）

谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)含有巰基的非蛋白化合物，它通過(guò)巰基發(fā)揮抗氧化作用，是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化劑和一些自由基清除劑。氧自由基對(duì)精子具有特別大的影響，而GSH可與氧自由基結(jié)合直接加以清除；有研究證明射出后精子與附睪處的精子比較，谷胱甘肽含量大大降低，如要保護(hù)體外精子就需要大量的GSH進(jìn)行抗氧化作用。Stradaioli[23]研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽能夠有效提高凍后精子活力。吳大平[10]研究表明適量添加GSH可以提高地中海水牛凍精活力，保護(hù)質(zhì)膜完整率并能降低精子的畸形率。

4.2 丙酮酸鹽

丙酮酸鹽是三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的樞紐，是細(xì)胞的能源物質(zhì)。丙酮酸鹽具有多細(xì)胞/組織的保護(hù)功能，除了能夠抗疲勞、降血脂、保護(hù)心肌，還有極好的抗氧化性。有研究表明，丙酮酸能抑制體內(nèi)氧自由基的氧化作用[24]，還是一種過(guò)氧化氫清除劑，具有防止過(guò)氧化損傷的作用。國(guó)外將丙酮酸鹽應(yīng)用于動(dòng)物精液的低溫冷凍保存[25～28]的研究很多，國(guó)內(nèi)的研究相對(duì)較少。胡傳活等[29]在牛冷凍精液稀釋液中添加丙酮酸鹽發(fā)現(xiàn)凍精品質(zhì)有一定的提高。

4.3 褪黑素（MLT）

褪黑素是一種胺類激素。褪黑素及其代謝產(chǎn)物可以直接清除活性氧，抑制細(xì)胞內(nèi)促氧化酶活性。褪黑素是減少細(xì)胞氧化損傷最有效的物質(zhì)之一，可直接通過(guò)抑制氧化反應(yīng)來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、核酸、蛋白質(zhì)等；也可以通過(guò)激活體內(nèi)過(guò)氧化物酶而間接發(fā)揮抗氧化作用。楊寶衛(wèi)等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能有效降低凍后豬精子的畸形率，并能提高活力[30]。李方舟等[31]發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠提高低溫保存的羊精液品質(zhì)和存活時(shí)間。吳大平[10]研究表明，在水牛精液冷凍稀釋液中，添加褪黑素可以降低精子的畸形率，提高凍后精子活力。吳美靈[32]發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠提高安格斯牛冷凍精液活力和質(zhì)膜完整率。

5 小結(jié)與展望

抗氧化劑可利用其保持蛋白穩(wěn)定性、消除過(guò)氧化氫、消除活性氧、與膜上磷脂相結(jié)合、抑制促氧化酶活性等特性來(lái)保護(hù)精子免受過(guò)氧化損傷，保持質(zhì)膜完整性，降低精子凍后畸形率，提高精液凍后品質(zhì)。因此添加外源抗氧化劑在精液保存應(yīng)用研究中有廣闊的前景，其對(duì)于加速精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，提高優(yōu)秀種畜的利用率都具有重大的意義。基于目前研究中所取得的一些進(jìn)展，進(jìn)一步深入研究，必將在冷凍精液保存技術(shù)上取得重大突破。