不同添加物對(duì)牛冷凍精液質(zhì)量的影響

王彥平，麻柱，王麗云，李艷華，呂小青

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192）

到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)牛冷凍精液稀釋液的研究已較為成熟，商業(yè)化冷凍精液稀釋液生產(chǎn)也較為普遍，但對(duì)精液冷凍技術(shù)還需要深入研究，以解決精液冷凍-解凍后精子質(zhì)量達(dá)不到理想效果的問題。本文通過(guò)對(duì)不同添加物對(duì)牛冷凍精液質(zhì)量方面的影響進(jìn)行綜述，為生產(chǎn)中牛精液的冷凍和保存提供一定的參考，以提高冷凍精液的質(zhì)量。

牛冷凍精液的冷凍-解凍過(guò)程均會(huì)對(duì)精子質(zhì)膜造成生理、生化功能的紊亂，導(dǎo)致精子活力降低、精子膜損傷、DNA片段斷裂、細(xì)胞內(nèi)酶的泄露，最終影響受精能力[1～3]。另外，牛精子含有高濃度的多不飽和脂肪酸，當(dāng)活性氧水平升高時(shí)，極易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[4]，造成精子細(xì)胞的氧化損傷[5]，致使精子功能下降、誘導(dǎo)精子凋亡[6]。

冷凍精液稀釋液是影響精液質(zhì)量和受胎率的重要因素。因此，優(yōu)質(zhì)的稀釋液是冷凍成功的關(guān)鍵，目前我國(guó)應(yīng)用較廣的稀釋液為檸檬酸鈉-果糖-卵黃-甘油稀釋液，該稀釋液具有相對(duì)穩(wěn)定的pH值及滲透壓，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在此基礎(chǔ)上添加不同的物質(zhì)以更好地保護(hù)精子不受冷應(yīng)激的打擊，保證冷凍精液質(zhì)量。目前牛冷凍精液稀釋液添加物質(zhì)包括酶類、激素類、氨基酸類等物質(zhì)。

1 酶類

牛精液在平衡、冷凍、解凍等過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量活性氧自由基對(duì)精子活力和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)造成損傷，改變質(zhì)膜脂質(zhì)組分和頂體結(jié)構(gòu)，甚至造成DNA片段化，最終影響母牛受胎率。雖然在精漿中存在能夠清除O2-、H2O2等的抗氧化酶，但牛精子本身并不含有過(guò)氧化氫酶，含有的谷胱甘肽過(guò)氧化酶較少，不足以抵抗ROS的作用，從而使精子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。由于精液質(zhì)量下降最終降低受精能力和早期胚胎發(fā)育、著床能力。

在精液冷凍解凍過(guò)程中減少過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)生，對(duì)維持牛精子的活力和運(yùn)動(dòng)能力發(fā)揮重要作用。因而可在精液冷凍時(shí)適當(dāng)添加一定量的抗氧化酶類，減少精子的氧化損傷[7]，主要有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶等。酶類抗氧化劑可分解精子代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，消除其危害以提高精子活率。張文舉等[8]、易康樂等[9]研究表明牛精液稀釋中添加谷胱甘肽、SOD后精子活力和母牛受胎率明顯提高。添加半胱氨酸和谷胱甘肽可降低冷凍對(duì)牛精子DNA的損害程度；Bilodeau等報(bào)道，在精液稀釋液中添加少量的過(guò)氧化氫酶和丙酮酸鹽，不僅可以保持精子的運(yùn)動(dòng)[10]，還可增加細(xì)胞的ATP水平，二者可以改善常用抗氧化劑的性能[11]。

2 維生素類

添加維生素能改善精子活率，提高精子的受精力[12]。維生素類包括維生素C、維生素E、維生素B12等。在牛冷凍精液稀釋液中添加維生素E后，不僅能夠有效提高精子的運(yùn)動(dòng)性能和頂體完整率，而且能夠顯著提高過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等的活性。Hu等[13]研究表明，稀釋液中添加維生素E能夠增強(qiáng)牛精子抗氧化酶的活性，從而提高精子冷凍-解凍后的質(zhì)量。維生素C能夠有效防止精液冷凍過(guò)程中精子磷脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，提高凍后精子質(zhì)量。稀釋液中添加維生素C可以明顯減少丙二醛的含量，提高冷凍-解凍后牛精子的活力。Cheede[14]研究表明，稀釋液中補(bǔ)充維生素C明顯改善了精液質(zhì)量，提高了人工授精后水牛的受胎率。趙憲林等[15]證明維生素C具有減緩精子死亡的作用。維生素B12能夠改善精子的外在環(huán)境，提高精子的活力，有研究認(rèn)為應(yīng)用維生素B12注射液進(jìn)行稀釋能夠延長(zhǎng)精子存活時(shí)間。孫淑琴等發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加維生素B12，解凍后精子在活力和頂體完整率上得到顯著提高[16]。

3 激素及激素前體類

催產(chǎn)素(OXT)、前列腺素E型(PGE)、F型(PGF2α)等，能促進(jìn)母畜生殖道蠕動(dòng)，有利于精子運(yùn)行，從而提高受胎率。加入孕酮可以誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，Thomas等發(fā)現(xiàn)孕酮通過(guò)使環(huán)境中的鈣離子迅速內(nèi)流而促發(fā)頂體反應(yīng)[17]；雌激素對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)起重要作用，可以增強(qiáng)子宮平滑肌收縮，有利于精子運(yùn)動(dòng)，提高受精力。褪黑激素可以刺激過(guò)氧化歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的抗氧化酶活性，抑制過(guò)氧化脂質(zhì)含量的升高，清除羥自由基，在精液冷凍過(guò)程中有重要的抗氧化作用。李曉霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)稀釋液中添加褪黑激素可以抑制ROS誘發(fā)的精子氧化損傷，提高精液質(zhì)量和保存時(shí)間。

冷凍解凍會(huì)使精子提前發(fā)生獲能反應(yīng)，降低精子存活時(shí)間，影響受胎率。利用膽固醇 β-環(huán)糊精包合體，可使精子膜穩(wěn)定，顯著提高哺乳動(dòng)物常規(guī)精液的活力，Yadav 等研究表明環(huán)糊精膽固醇包合物(CLC)可顯著增加牛冷凍精液活力及頂體完整率[19,20]。陳軍等研究表明，冷凍精液稀釋液中添加適宜濃度的CLC可顯著提高牛精子凍后活率[21]。Moraes等研究表明，在牛精子膜中添加膽固醇或膽甾醇可以提高細(xì)胞的冷凍存活率，膽固醇還融入了所有的精子膜[22]。通過(guò)在冷凍前向細(xì)胞中添加CLC提高膜膽固醇水平，是一種簡(jiǎn)單的提高牛精子冷凍存活率的技術(shù)，但CLC是否影響牛冷凍精子的受精力，需要進(jìn)一步做體外授精或人工授精后得出結(jié)論 。

4 能量物質(zhì)

海藻糖、ATP、精氨酸、咖啡因等能提高精子保存后活率?？Х纫蚩墒咕舆\(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[23]，Baraka等研究表明牛冷凍精液解凍后添加不同濃度的咖啡因可以顯著提高冷凍精液運(yùn)動(dòng)能力[24]。海藻糖可以減緩細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化，從而保護(hù)細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)不被破壞。Chen等研究證明，海藻糖能提高冷凍保存的牛精子活力，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間[25]。另外，聯(lián)合添加海藻糖、牛血清白蛋白可顯著提高牛冷凍精液質(zhì)量。牛冷凍精液稀釋液中添加適量海藻糖，可提高冷凍精液活力、線粒體活性以及DNA的完整性[26]。

5 氨基酸

研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸具有很好的營(yíng)養(yǎng)及抗氧化作用。Topraggaleh 等在精液冷凍保存擴(kuò)展劑中添加半胱氨酸和谷氨酰胺，發(fā)現(xiàn)可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS，進(jìn)而提高水牛凍融精子的活力和膜完整性[27]。而胡傳話等[28]添加不同濃度和組合的半胱氨酸、丙氨酸和精氨酸，均未能顯著提高精液的凍后質(zhì)量。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)L-肉毒堿可促進(jìn)精子內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化歧化酶的活性和水平，而這些酶在精子冷凍過(guò)程中可清除ROS，減少細(xì)胞的氧化損傷[29]。抗氧化劑L-肉毒堿可促進(jìn)激活的脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)到線粒體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生。

精液冷凍過(guò)程中，精子膜的完整性對(duì)復(fù)蘇后精子的活力和受精能力至關(guān)重要。牛血清白蛋白（BSA）是一類蛋白質(zhì)類膜穩(wěn)定劑，具有緩沖pH變化、調(diào)節(jié)滲透壓、保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷等多方面的作用。據(jù)Chen等[25]報(bào)道，添加BSA后冷凍精液質(zhì)量顯著提高。稀釋液中添加BSA時(shí)母牛妊娠率最高，但氨基酸應(yīng)用于精液稀釋液的種類及效果還有待進(jìn)一步研究。

6 無(wú)機(jī)鹽類物質(zhì)

丙酮酸鹽是細(xì)胞的能源物質(zhì)，而且具有極好的抗氧化功能。胡傳話等在常用的果糖-檸檬酸鈉-卵黃-甘油液的基礎(chǔ)上分別添加丙酮酸鉀、丙酮酸鈉或丙酮酸鈣，結(jié)果冷凍精液質(zhì)量明顯提高[28]。目前丙酮酸鹽已經(jīng)作為重要的添加物質(zhì)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

7 有機(jī)物質(zhì)

稀釋液中添加有機(jī)物質(zhì)，主要用于改善精子所處環(huán)境的理化特性以及母畜生殖道的生理機(jī)能，有利于提高精子活力和延緩精子衰老，同時(shí)有利于精子的獲能和受精。丁基羥基甲苯可顯著提高荷斯坦牛冷凍精液質(zhì)量[30]。十二烷基磺酸鈉(SDS)是一類表面活性劑，可使卵黃中的卵磷脂充分釋放，在冷凍稀釋液添加SDS，精液解凍后精子質(zhì)量良好。乙二胺四乙酸(EDTA)有保護(hù)精子抗冷休克的作用，又可通過(guò)改變細(xì)胞膜滲透性，降低精子活動(dòng)，從而延長(zhǎng)精子壽命并保持受精能力。

8 其他物質(zhì)

此外，添加己酸、植物汁液等可以調(diào)節(jié)稀釋液的pH；乙烯二醇、聚乙烯毗咯烷酮等均有保護(hù)精子的作用；Nattat和Sheshtawy研究表明，冷凍稀釋液中添加一定濃度的草莓汁可顯著增加冷凍精液質(zhì)量[31]。中藥提取液在冷凍和解凍過(guò)程中能有效保護(hù)精子，提高凍后精子的質(zhì)量和受精能力[32]。張鶯鶯等研究表明，冷凍稀釋液中添加淫羊藿、巴戟天、菟絲子、黃芪、甘草或淫羊藿、益母草、雞冠花均能提高精子活率、頂體完整率[33]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作為綠茶中一種具有強(qiáng)抗氧化能力的生物活性化合物，通過(guò)清除超氧陰離子和羥自由基，以及增強(qiáng)其他抗氧化酶活性等途徑發(fā)揮抗氧化作用。黃自強(qiáng)等研究表明，牛冷凍精液中添加不同濃度的EGCG可提高精子質(zhì)膜、頂體和線粒體膜完整率，降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并提高受精后早期胚胎發(fā)育能力[34]。

目前，不同添加物質(zhì)在牛精液冷凍保存中的應(yīng)用對(duì)于提高精子質(zhì)量作用顯著，但對(duì)添加物質(zhì)的研究主要集中于單獨(dú)應(yīng)用方面，不同添加物的聯(lián)合應(yīng)用則少有報(bào)道，各添加物之間是否有協(xié)同作用的研究也較少，因此，在牛精液冷凍保存技術(shù)的優(yōu)化方案尤其是稀釋液配方的添加物質(zhì)方面，應(yīng)開展深入的研究，這是今后牛精液冷凍保存研究中值得重視的主要環(huán)節(jié)之一。