自噬抑制劑3-MA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用的研究進(jìn)展

封秀梅，許明敏，黃 辰，李 瑛，張 微

(成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610075)

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的細(xì)胞降解途徑，是機(jī)體內(nèi)存在的一種自我修復(fù)和維持生命的過(guò)程[1]。近年來(lái)，自噬作用正逐漸成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的熱點(diǎn)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)自噬與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2-4]，而自噬抑制劑又被認(rèn)為是探究疾病與自噬相關(guān)性以及開拓疾病新的治療措施的關(guān)鍵點(diǎn)。1892年Seglen等[5]用饑餓Wistar大鼠分離的肝細(xì)胞篩選嘌呤相關(guān)物質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)了3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可作為自噬抑制劑，自此以后3-MA被普遍應(yīng)用于自噬的機(jī)制研究，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中應(yīng)用尤為廣泛。文章綜述了3-MA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病自噬研究中的作用及其應(yīng)用概況，以期為疾病的預(yù)防和臨床治療提供一定的參考和指導(dǎo)。

1 3-MA與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

1.1 3-MA與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury)是因各種原因造成腦組織缺血，經(jīng)再灌注恢復(fù)供血后，機(jī)體損傷癥狀未得到改善反而加重的現(xiàn)象，是缺血性卒中主要的病理生理機(jī)制[6]。1995年Nitatori等[7]采用透射電子顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞中存在自噬現(xiàn)象。近年來(lái)學(xué)者們也從生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)等方面，先后證實(shí)了在腦缺血不同階段皆存在自噬激活現(xiàn)象，但3-MA在腦缺血中的確切作用一直存在著很大爭(zhēng)議。Puyal等[8]發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)的微管相關(guān)蛋白LC3-II在缺血再灌注早期的數(shù)小時(shí)內(nèi)開始升高，而使用3-MA則可顯著下調(diào)LC3-II的表達(dá)，同時(shí)減輕腦損傷，減小腦梗死病變區(qū)域。Wang等[9]于腦缺血再灌注后2 h經(jīng)側(cè)腦室分別注射促黑激素(intermedin，IMD)和3-MA進(jìn)行治療，24 h后發(fā)現(xiàn)IMD組和3-MA組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I表達(dá)均較模型組明顯降低，提示IMD與3-MA具有相似的作用，均可改善病理性神經(jīng)元損傷。Wen等[10]也揭示了3-MA可顯著減小腦梗死體積，降低腦水腫及運(yùn)動(dòng)缺失表現(xiàn)。相反地，Carloni等[11]發(fā)現(xiàn)腦缺血后皮質(zhì)及海馬區(qū)的Beclin-1在短時(shí)間內(nèi)顯著上調(diào)，且只在發(fā)生缺血缺氧損傷的神經(jīng)元中表達(dá)，應(yīng)用3-MA可加重腦損傷，明顯增多壞死細(xì)胞數(shù)量，提示3-MA在缺血缺氧早期對(duì)神經(jīng)元具有損傷作用。Sheng等[12]同樣證實(shí)了3-MA可有效阻斷自噬的活性，降低缺血預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷腦組織的保護(hù)作用，加劇神經(jīng)細(xì)胞的壞死。

關(guān)于3-MA在腦缺血再灌注損傷中呈現(xiàn)出如此不同的作用，初步猜測(cè)主要是因?yàn)樵谀X缺血的不同階段自噬被激活的程度不一致。Shi等[13]在實(shí)驗(yàn)中觀察到了3-MA在復(fù)氧不同階段的雙重作用，在24 h前再灌注，3-MA引發(fā)神經(jīng)元死亡率高，而48～72 h再灌注，3-MA具有明顯保護(hù)神經(jīng)元的作用，延長(zhǎng)再灌注會(huì)引發(fā)過(guò)度的自噬，3-MA的作用也發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)變。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)造模方式會(huì)影響3-MA的作用，在永久性腦缺血模型小鼠中，通過(guò)3-MA預(yù)處理可減小梗死面積，而在短暫性腦缺血模型小鼠中，再灌注開始后立即進(jìn)行3-MA治療反而增加了梗死面積。此外，缺血程度、缺血區(qū)域、3-MA注射時(shí)間和注射周期、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等也可能是相關(guān)影響因素。因此，3-MA在腦缺血再灌注損傷中是加重還是減輕腦損傷不可一概而論，需考慮諸多可能的影響因素，進(jìn)一步深入研究，若能正確引導(dǎo)自噬使其適時(shí)地在腦缺血的防治中發(fā)揮積極作用，這將為其治療開啟新紀(jì)元。

1.2 3-MA與脊髓損傷

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損和運(yùn)動(dòng)功能障礙[15]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)3-MA在脊髓損傷中的作用值得深究。Zhang等[16]為研究自噬在脊髓損傷中的作用以及鋰的神經(jīng)保護(hù)作用，在脊髓損傷6 h后對(duì)鋰組大鼠腹腔注射1 ml鋰(30 mg/kg)，而3-MA組在注射鋰的同時(shí)還于損傷前2 h腹腔注射1 mL 3-MA(3 mg/kg)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋰能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)細(xì)胞存活，而3-MA下調(diào)了鋰誘導(dǎo)的自噬，抑制了其產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用。Li等[17]也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，于造模前20 min采用3-MA干預(yù)，能降低Beclin-1的表達(dá)，且抵消了雷帕霉素(rapamycin)產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用，加劇了神經(jīng)元胞體的凋亡。相反地，有研究者[18]在實(shí)驗(yàn)中自第十胸椎脊髓背側(cè)緩慢注射3-MA(200 nmol/L)，然后進(jìn)行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-MA對(duì)大鼠脊髓損傷具有保護(hù)作用。Lei等[19]的研究結(jié)果也支持3-MA在脊髓損傷中的積極作用。

Zhang等[16]與楊德剛等[18]的實(shí)驗(yàn)中3-MA發(fā)揮著相反的作用，注射部位可能是關(guān)鍵，尚待驗(yàn)證。在脊髓損傷后，自噬的水平將明顯上升，神經(jīng)元的自噬水平與脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)，正如Hou等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Fang等[21]亦發(fā)現(xiàn)在脊髓缺血再灌注早期3-MA加重了再灌注產(chǎn)生的損傷，而在損傷72 h后，3-MA則減少了神經(jīng)元的丟失，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。也有研究[22]間接證明3-MA在體外可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來(lái)調(diào)控脊髓損傷的修復(fù)進(jìn)程。因此，深入了解3-MA在脊髓損傷中的作用機(jī)制，對(duì)神經(jīng)損傷的恢復(fù)具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

1.3 3-MA與帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以多巴胺能(dopaminergic，DA)神經(jīng)元的進(jìn)行性、廣泛性丟失及其胞內(nèi)不溶性α突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)形成路易小體聚集為標(biāo)志的中樞神經(jīng)退行性疾病[23]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬功能障礙可致α-Syn清除受損，而α-Syn的增多又可造成自噬功能受損，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)異常聚集、線粒體功能障礙及神經(jīng)細(xì)胞毒性等[24-25]。此外，包括PARK7基因[26]、PINK1基因[27]、PARK8基因[28]等與PD相關(guān)的基因都在一定程度上參與了自噬的過(guò)程，而近年來(lái)對(duì)此病的干預(yù)也主要集中在對(duì)其自噬水平的調(diào)節(jié)研究上。Jin等[29]在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)應(yīng)用雷帕霉素和3-MA，結(jié)果顯示3-MA可增強(qiáng)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)激發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用，造成更多DA神經(jīng)元的丟失。Han等[30]在培養(yǎng)基中加入5 mM 3-MA，發(fā)現(xiàn)PLIN4沉默導(dǎo)致的神經(jīng)保護(hù)被3-MA抑制。然而，有研究者[31]使用自噬抑制劑3-MA證實(shí)肉桂醛在PD模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，提示抑制自噬可能是今后治療PD的新方向。

從當(dāng)前的證據(jù)來(lái)看，3-MA在PD中發(fā)揮著雙重作用，一方面，3-MA阻礙自噬清除錯(cuò)誤折疊的蛋白，從而導(dǎo)致PD的發(fā)生，而另一方面，3-MA可抑制過(guò)度激活的自噬，延緩PD的發(fā)展甚至避免PD的發(fā)生，再次驗(yàn)證了自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，不足或過(guò)度的自噬水平對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)都是不利的。因此，進(jìn)一步研究3-MA在PD中的調(diào)節(jié)機(jī)制，探討藥物治療的起效途徑，可為其治療提供新策略。

1.4 3-MA與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

3-MA在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也有運(yùn)用，如蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)及阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)等。Guo等[32]經(jīng)腦室注射3-MA，發(fā)現(xiàn)3-MA可抑制白藜蘆醇激活的自噬，減緩神經(jīng)功能的恢復(fù)。有研究[33]表明在小鼠TBI模型中，3-MA經(jīng)側(cè)腦室預(yù)給藥后，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)水平明顯降低，減少了神經(jīng)細(xì)胞死亡，減小了腦損傷面積，并能改善運(yùn)動(dòng)功能障礙，加速學(xué)習(xí)與記憶能力的恢復(fù)。有學(xué)者[34]發(fā)現(xiàn)電針能有效降低神經(jīng)元凋亡，改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，而在針刺前30 min經(jīng)腹腔注射3-MA(0.5 mg/kg)后針刺的治療效應(yīng)被阻斷。此外，在血管性癡呆[35]及癲癇[36]模型中，3-MA也被證實(shí)有助于神經(jīng)的損傷修復(fù)。

2 3-MA與周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病

周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)軸突出現(xiàn)脫髓鞘病變、斷裂變性和神經(jīng)水腫等，損害的遠(yuǎn)端出現(xiàn)瓦勒氏變性等一系列的病理性改變[37]，而自噬能清除雪旺細(xì)胞內(nèi)崩潰的髓鞘碎片和受損細(xì)胞器，促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)[38]。Lu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠再生的坐骨神經(jīng)主要通過(guò)細(xì)胞自噬來(lái)維持正常形態(tài)，而[40]3-MA恰恰通過(guò)抑制自噬起相反的作用，使軸突和髓鞘再生受到抑制。還有學(xué)者[41]通過(guò)結(jié)扎坐骨神經(jīng)建立神經(jīng)性疼痛模型，于術(shù)后1 h經(jīng)腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，證實(shí)了3-MA能抑制自噬，明顯惡化神經(jīng)病變狀況。相同的，Chen等[42]也證實(shí)了周圍神經(jīng)損傷激活了自噬，自噬參與了損傷的周圍神經(jīng)的更新和再生，使用3-MA則阻礙神經(jīng)的再生。

可見，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病中3-MA不利于神經(jīng)修復(fù)及再生。但目前3-MA在周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究局限于坐骨神經(jīng)損傷，尚缺乏對(duì)其他病種的研究。故筆者通過(guò)文獻(xiàn)研究認(rèn)為，擴(kuò)展病種，探索自噬在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)及再生中的具體作用及其可能機(jī)制具有重要的價(jià)值，這或許是今后研究的突破點(diǎn)。

3 3-MA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的使用

3-MA的注射頻次有單次注射[18]和多次注射[34,41]，可于造模前[16,35]或造模后[18,36]注射，主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的靈活選擇。由于3-MA作為自噬抑制劑對(duì)Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的作用是短暫的[43]，而自噬又是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，故若想觀察疾病不同時(shí)間點(diǎn)的自噬水平，最好每日注射。3-MA在實(shí)驗(yàn)中常選擇的注射部位為腹腔[16-17]或腦室[11,32]，也可經(jīng)尾靜脈[44]或者脊髓注射[18]。不同部位的起效方式不同，腹腔注射主要通過(guò)體液循環(huán)最終作用于病所，可調(diào)整全身的自噬水平，但靶向性不強(qiáng)；而腦室注射直接作用于特定腦區(qū)，針對(duì)性強(qiáng)，但對(duì)動(dòng)物的損傷較大，死亡率較高。在今后的研究中我們可多加論證其他部位注射的可行性，并進(jìn)一步摸索其起效量及產(chǎn)生的一系列副作用。3-MA在培養(yǎng)基中常選用的濃度為5 mmol/L[5,30]，活體實(shí)驗(yàn)中的使用濃度范圍在0.5～30 mg/kg[16,34,41]，這主要跟注射頻次及注射部位存在一定相關(guān)性。對(duì)于其配制方法，目前多用二甲基亞砜(dimethyl sulfone，DMSO)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、生理鹽水等溶解，也可以先用DMSO配制后再用PBS緩沖液緩沖至所需濃度。

4 3-MA作為自噬抑制劑的優(yōu)缺點(diǎn)

3-MA作為自噬抑制劑，其優(yōu)勢(shì)為對(duì)細(xì)胞的損害較小，且能夠特異性地抑制PI3K。PI3K是自噬激活的必要條件[45]，其主要有3種類型，分別是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PI3K。研究已證實(shí)了3-MA主要抑制Ⅲ型PI3K[46]，通過(guò)抑制Beclin-1-PtdIns 3KC3 復(fù)合物的形成來(lái)抑制胞漿可溶性形式LC3-I向自噬體膜結(jié)合形式LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化。最近的研究[43]表明3-MA在培養(yǎng)基中具有雙重作用，在營(yíng)養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基中抑制自噬，而在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的治療可促進(jìn)自噬。關(guān)于3-MA促進(jìn)自噬的研究目前較少，Wu等[43]證實(shí)了3-MA能持續(xù)阻斷Ⅰ型PI3K，其可能是通過(guò)抑制Ⅰ型PI3K下游的信號(hào)分子蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)在Thr308和Ser473處的磷酸化來(lái)激活自噬[47]，有待驗(yàn)證。此外，3-MA在室溫下溶解性差，一般在使用前需在60℃～70℃的水浴中加熱促溶[48]，且僅在高濃度下有效。所以，開發(fā)可溶性高、特異性強(qiáng)的自噬抑制劑對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究是至關(guān)重要的。有研究[49]通過(guò)化學(xué)修飾3-MA，合成得到了三個(gè)3-MA的衍生物，它們表現(xiàn)出更高的可溶性和更強(qiáng)的特異性，且僅抑制Ⅲ型PI3K而不抑制Ⅰ型PI3K，不足的是對(duì)細(xì)胞存在一定毒性作用，可見利用化學(xué)修飾可能是優(yōu)化3-MA性能的一種行之有效的方法。

自噬的機(jī)制十分復(fù)雜，3-MA不能完全抑制所有的自噬途徑，還有許多不受3-MA調(diào)控的信號(hào)通路。單純自噬體的減少不能準(zhǔn)確判定自噬被抑制，有可能是自噬體與溶酶體的融合受阻，所以還需結(jié)合使用自噬體與溶酶體融合的抑制劑氯喹、巴佛洛霉素A1或敲除溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2來(lái)觀察自噬流的變化，進(jìn)一步評(píng)判是否成功抑制自噬，以得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有研究顯示[5]5 mmol/L 3-MA對(duì)于自身自噬的阻斷可達(dá)到60%。然而，在研究電針對(duì)自噬水平影響的實(shí)驗(yàn)中，3-MA似乎完全抵消了針刺的保護(hù)效應(yīng)[35]，最可能的解釋是3-MA可抑制通過(guò)針刺預(yù)處理誘導(dǎo)的大部分自噬。郭科等[36]在造模后固定于每日上午8點(diǎn)注射3-MA，故3-MA的起效機(jī)制是否受晝夜節(jié)律影響有待驗(yàn)證。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上，自噬抑制劑3-MA被多方證實(shí)參與了神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)及再生過(guò)程，與大部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系也已被廣泛研究并迅速成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但在其中的具體作用受諸多因素影響。此外，缺乏高效的自噬抑制劑依舊是理解自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的生理病理作用的障礙所在，3-MA作為相對(duì)成熟的自噬抑制劑，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中應(yīng)用較為靈活，但仍存在諸多不足之處。因此，探索3-MA的更多特性，明確其在疾病不同狀態(tài)下的作用是當(dāng)下需重點(diǎn)突破的難題，也將是今后神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的關(guān)鍵所在。