光照血栓中風(fēng)模型的研究進(jìn)展

翟羽佳，穆寒露，何蓉蓉，李怡芳*

(1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心藥學(xué)部，廣州 510623； 2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632； 3.廣東省疾病易感性及中醫(yī)藥研發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣州 510632)

中風(fēng)又稱(chēng)為腦卒中，是一種影響大腦內(nèi)部血管和神經(jīng)的疾病。全球每年約有1500萬(wàn)人中風(fēng)，500萬(wàn)人死于中風(fēng)[1]。中風(fēng)主要分為出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)，一般缺血性中風(fēng)影響大腦和大腦內(nèi)的動(dòng)脈血管，占所有中風(fēng)事件的80%。如果與其他腦血管疾病分開(kāi)考慮，中風(fēng)是僅次于心臟病、癌癥、慢性下呼吸道疾病和意外傷害的第五大致死因素。缺血性中風(fēng)俗稱(chēng)腦梗死，一般是由血栓阻塞血管導(dǎo)致的。血管阻塞后致使血流無(wú)法通過(guò)導(dǎo)致組織無(wú)法得到氧氣及糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，ATP產(chǎn)生紊亂，金屬離子通道打開(kāi)引起鈉、鉀、鈣等離子流動(dòng)紊亂，級(jí)聯(lián)興奮性氨基酸的釋放、自由基的產(chǎn)生、線(xiàn)粒體的損傷等進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡。血腦屏障的破壞導(dǎo)致外周物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)而加劇損傷過(guò)程，其中又有炎癥反應(yīng)的參與。近些年來(lái)，研究人員利用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)幾千個(gè)化合物進(jìn)行了研究，進(jìn)行了數(shù)以百計(jì)的臨床試驗(yàn)。即使有些化合物在體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示出了抗中風(fēng)的效果，但在臨床試驗(yàn)中效果并不理想。迄今為止，組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)是迄今為止唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為缺血性中風(fēng)的臨床治療用藥。然而，tPA做為一種溶栓劑在實(shí)際使用中受到治療窗的限制，臨床上只有少數(shù)患者可以接受tPA的治療[2-3]。同時(shí)，在中風(fēng)的科學(xué)研究中，合適的中風(fēng)研究模型對(duì)于病理機(jī)制和藥物研發(fā)是非常重要的支撐和保障，目前最常用的缺血中風(fēng)模型有栓線(xiàn)法、栓子注射法及光照血栓法。本文闡述了光照血栓中風(fēng)模型的特點(diǎn)及應(yīng)用，并與其他中風(fēng)模型進(jìn)行了對(duì)比(表1)。

表1 幾種缺血性中風(fēng)模型的比較

1 常見(jiàn)的幾種腦缺血中風(fēng)模型

目前，許多腦缺血中風(fēng)動(dòng)物模型被用于研究腦缺血損傷的細(xì)胞和分子機(jī)制以及抗中風(fēng)藥物的研發(fā)，其中包括神經(jīng)保護(hù)劑的研發(fā)及改善血腦屏障通透性藥物的研發(fā)。嚙齒類(lèi)動(dòng)物中風(fēng)模型被應(yīng)用的最為廣泛，不同的嚙齒類(lèi)動(dòng)物中風(fēng)模型只能部分地從不同方面模擬人類(lèi)的中風(fēng)過(guò)程，但不能模擬全部類(lèi)型。常用的局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ桶ㄋㄗ幼⑸浞?、線(xiàn)栓法、光照血栓法(光化學(xué)法)等[4]。

栓子注射法局灶性腦缺血血栓栓塞模型是從頸內(nèi)動(dòng)脈注射外源性凝血酶凝塊或合成凝血酶阻塞微球體(300 ～ 400 μm)或微球(< 50 μm)。此方法可以較好的模擬人類(lèi)的中風(fēng)過(guò)程，適用于對(duì)中風(fēng)生理病理過(guò)程的研究和溶栓藥物/神經(jīng)保護(hù)藥物的開(kāi)發(fā)，但是模型對(duì)于中風(fēng)的區(qū)域位置、大小和缺血持續(xù)時(shí)間等很難控制，重復(fù)性較差，造作過(guò)程中需要麻醉[4]。

栓線(xiàn)法是制造局灶性缺血中風(fēng)模型的常用方法，用來(lái)制造永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)，或者暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)及缺血再灌注。在MCAO模型中，通常經(jīng)頸外動(dòng)脈缺口插入圓形硅膠包覆尖端的尼龍單絲線(xiàn)直到頸內(nèi)動(dòng)脈來(lái)制造單側(cè)MCAO模型[5]。MCAO是通過(guò)在顱骨上安裝激光多普勒血流儀探頭，用于監(jiān)測(cè)阻塞開(kāi)始時(shí)皮質(zhì)血流進(jìn)而確定手術(shù)的有效性。栓子插入后可以一直放在腦中，形成的是pMCAO模型。對(duì)于tMCAO模型，栓子停留時(shí)間一般是30～120 min，然后拔出栓子形成缺血后再灌注。MCAO模型可以形成較大的缺血面積并且有缺血半暗帶，可以很好的模擬人類(lèi)的中風(fēng)過(guò)程，重復(fù)性也較好[6-7]。MCAO模型在缺血性中風(fēng)中的神經(jīng)再生、炎癥過(guò)程及血腦屏障損傷等的細(xì)胞分子機(jī)制研究和抗中風(fēng)藥物的開(kāi)發(fā)中得到了廣泛應(yīng)用[8]。但是，此模型對(duì)操作技術(shù)要求很高，這一點(diǎn)嚴(yán)重影響到了模型的成功率及動(dòng)物術(shù)后的死亡率。同時(shí)，此模型在手術(shù)過(guò)程中需要大量的麻醉劑及較長(zhǎng)的麻醉時(shí)間，還容易產(chǎn)生血管破裂和出血等。此外，此模型不適合溶栓藥物的開(kāi)發(fā)研究[4]。

2 光照血栓模型

光照血栓模型又叫做光化學(xué)血栓模型，1985年Watson等[9]人將其作為大鼠局灶性腦梗死的一種技術(shù)，后來(lái)很多研究將其拓展應(yīng)用于小鼠[10-12]。此模型主要原理是靜脈注射光敏感性染料，如孟加拉玫瑰染料之后在顱骨局部照射引起的光化學(xué)反應(yīng)。光敏感性染料是水溶性的，并且不能透過(guò)血腦屏障，因此只能在血液中存在附著于內(nèi)皮，結(jié)合血小板等血液細(xì)胞(圖1)。激光照射誘導(dǎo)孟加拉玫瑰染料局部活化，導(dǎo)致腦部小血管單線(xiàn)態(tài)氧等自由基形成，活性氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成的細(xì)胞膜氧化損傷導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，使血小板聚集進(jìn)而形成血栓，阻塞微小血管導(dǎo)致局部血栓形成，進(jìn)一步造成大腦缺血和神經(jīng)細(xì)胞的死亡及血腦屏障的開(kāi)放[13]。與其他腦中風(fēng)動(dòng)物模型相比，此模型相對(duì)制造簡(jiǎn)單，因?yàn)槠洳恍枰獧C(jī)械性操作腦血管或腦實(shí)質(zhì)。病灶大小和位置可以通過(guò)改變輻照強(qiáng)度、曝光時(shí)間、光束位置及染料濃度來(lái)調(diào)節(jié)。除此之外，光照血栓性梗死可以長(zhǎng)期存在，因此適合于腦中風(fēng)的長(zhǎng)期研究[14-15]。

圖1 光照血栓中風(fēng)模型示意圖Figure 1 Schematic diagram of the induction of photothrombotic stroke

2.1 光照血栓模型的病理機(jī)制

光照血栓的病理過(guò)程與其它模型有共同點(diǎn)，也有本身的獨(dú)特性。在激光照射后與血液內(nèi)染料接觸，單態(tài)氧及自由基的產(chǎn)生可以迅速的導(dǎo)致血小板的凝集和纖維蛋白凝塊的生成而形成血栓[14, 16]。血管內(nèi)血栓阻塞了血液的流動(dòng)，導(dǎo)致氧氣和葡萄糖的缺乏，進(jìn)而是氧化磷酸化和ATP生成紊亂[17]，導(dǎo)致細(xì)胞離子通道的異常開(kāi)放，如Na+的內(nèi)流和K+的外流，致使細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓改變，誘導(dǎo)細(xì)胞水腫。同時(shí)谷氨酸大量釋放與NMDA受體結(jié)合后級(jí)聯(lián)下游效應(yīng)。Ca2+釋放內(nèi)流到細(xì)胞內(nèi)，與線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，進(jìn)一步的產(chǎn)生ROS(包括O2-、ONOO-、OH-等)，開(kāi)啟程序性細(xì)胞死亡過(guò)程[18]。此外，ATP的匱乏、Ca2+的內(nèi)流和ROS都可以使細(xì)胞膜損傷，破壞細(xì)胞的構(gòu)架，除了導(dǎo)致細(xì)胞死亡之外，還會(huì)影響到血腦屏障的穩(wěn)定性[19-21]。血腦屏障作為大腦的屏障，一旦受到破壞則使正常生理狀態(tài)下大腦中不存在的物質(zhì)進(jìn)入大腦，加劇病理過(guò)程[22]。Ca2+可以激活內(nèi)切核酸酶，與產(chǎn)生的ROS都可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷[23]。同時(shí)，Ca2+誘導(dǎo)的鈣蛋白酶和組織蛋白酶的上調(diào)使細(xì)胞內(nèi)多種蛋白降解，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[24-25]。ROS可以激活JNK/Bcl-2，NF-κB等信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[26-27]。另外，ROS也可以引起鐵凋亡[28]。多種死亡形式可能同時(shí)發(fā)生在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中。病理過(guò)程中炎性反應(yīng)的參與，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的死亡及血腦屏障的破壞也有一定的促進(jìn)作用[29]。

光照血栓可以直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血腦屏障的骨架架構(gòu)，損傷后直接導(dǎo)致血腦屏障通透性的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞外水腫的形成[30]。所以在光照血栓模型中，細(xì)胞水腫和血管源性細(xì)胞外水腫幾乎同時(shí)在早期發(fā)生，這一點(diǎn)與MCAO模型及臨床情況有所差別。圖2為光照血栓中風(fēng)損傷機(jī)制示意圖。

圖2 光照血栓中風(fēng)損傷機(jī)制示意圖Figure 2 Schematic diagram of the damaging mechanism of photothrombotic stroke

2.2 光照血栓模型的優(yōu)點(diǎn)

光照血栓性中風(fēng)的主要特點(diǎn)是大腦小血管的阻塞。此模型的優(yōu)勢(shì)非常明顯，主要有以下幾點(diǎn)：第一，光照血栓可以預(yù)設(shè)在特定的區(qū)域。與臨床中通常發(fā)生的腦中動(dòng)脈阻塞中風(fēng)不同，光照血栓形成在暴露于激光照射的區(qū)域內(nèi)，在血管內(nèi)的血液中形成栓子，同時(shí)損傷淺表血管及阻滯血液流動(dòng)。因此調(diào)節(jié)激光的照射位置、強(qiáng)度、照射時(shí)間及血液中染料的劑量，可以對(duì)血栓及病灶部位、大小進(jìn)行相應(yīng)的控制[12, 31]。第二，此模型的神經(jīng)損傷分子機(jī)制與永久性腦中風(fēng)大體相似，都可以在腦中血管阻塞后引起糖氧剝奪，進(jìn)而引起一系列反應(yīng)導(dǎo)致?lián)p傷。因此適用于病理過(guò)程、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)再生的細(xì)胞和分子機(jī)制研究，以及預(yù)防治療中風(fēng)藥物的開(kāi)發(fā)研究[32-38]。第三，光照血栓模型的創(chuàng)傷性相對(duì)小，不需要開(kāi)顱手術(shù)而只是需要打開(kāi)被照射部位的皮膚及使顱骨變薄，因此操作簡(jiǎn)單。并且模型動(dòng)物的死亡率低，通常低于10%，遠(yuǎn)低于其它中風(fēng)模型[39]。第四，許多研究證明此模型所誘導(dǎo)的中風(fēng)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，相關(guān)神經(jīng)功能障礙時(shí)間持續(xù)久，對(duì)于長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察驗(yàn)證具有優(yōu)勢(shì)[31, 39]。第五，與其它模型相比，對(duì)血壓和血管結(jié)構(gòu)的遺傳變異具有獨(dú)立性，并且此模型可以凝集血小板，因此可以用于血小板的血栓相關(guān)炎癥和凋亡的研究[40]。第六，此模型使用的麻醉時(shí)間相對(duì)較短，可以盡可能少的減少麻醉劑對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾[4, 10]。

2.3 光照血栓模型的缺點(diǎn)

首先，光照血栓性梗死不僅僅阻塞血管，并且會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷血管壁，在早期引起非典型血管源性水腫。這一點(diǎn)與實(shí)際臨床中的中風(fēng)發(fā)病過(guò)程有著較大的差異，不能很好的模擬人類(lèi)中風(fēng)水腫生成情況。光照血栓可以同時(shí)引起細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)水腫和細(xì)胞外的血管性水腫，是一個(gè)雙重水腫幾乎同時(shí)發(fā)生的過(guò)程。然而，臨床中病人中風(fēng)的特點(diǎn)是細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)水腫首先發(fā)生，接下來(lái)幾個(gè)小時(shí)逐漸生成血管性水腫[41]。其次，與其它局灶性中風(fēng)模型相比，光照血栓性的另一個(gè)缺點(diǎn)是由于細(xì)胞壞死和組織水腫的程度較重，導(dǎo)致此模型的局部缺血半暗帶狹窄或缺失[17, 30, 42]，并且只有少量的或者觀(guān)察不到局部側(cè)支血流及缺血再灌注過(guò)程[42]。由于逆轉(zhuǎn)缺血半暗帶是臨床上神經(jīng)保護(hù)治療的主要目標(biāo)之一，所以此模型在這一方面的應(yīng)用不是十分理想。再次，與其它中風(fēng)模型比較由于皮質(zhì)部位病灶損傷區(qū)相對(duì)較小，動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能損傷也相對(duì)較輕[39]。另外，在臨床實(shí)際情況中，典型的局灶性缺血性中風(fēng)涉及大腦中動(dòng)脈中特定節(jié)段的血栓阻塞，而不是在大腦皮質(zhì)中眾多小動(dòng)脈和微血管中的血栓阻塞[4]。

3 光照血栓中風(fēng)模型在藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

無(wú)論是預(yù)防性給藥還是造模后治療性給藥，已有許多針對(duì)缺血性中風(fēng)的藥物利用光照血栓模型進(jìn)行了研究及驗(yàn)證。有些研究通過(guò)此模型尋找抑制鈣通道、谷氨酸興奮性毒性和氧化應(yīng)激的化合物進(jìn)而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的目的。Lorrio等[43]人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，化合物ITH33/IQM9.21可以通過(guò)減少鈣超載，保護(hù)線(xiàn)粒體并且具有抗氧化的作用而改善缺血性中風(fēng)。Aerden等[34]發(fā)現(xiàn)地西泮做為鈣離子通道阻滯劑，可以有效地減小大鼠光照血栓模型的腦梗死面積。有些研究通過(guò)一些相關(guān)酶或者受體的效應(yīng)探討一些藥物的藥效及作用機(jī)制[44]。López-Valdés等[50]認(rèn)為美金剛可以拮抗谷氨酸受體，起到改善中風(fēng)的作用。Park等[38]發(fā)現(xiàn)二甲胺四環(huán)素強(qiáng)力霉素可以再光照血栓模型中抑制金屬蛋白酶9(MMP-9)，而MMP-9與緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)有著重要的聯(lián)系，影響血腦屏障。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)煙酰胺在可以通過(guò)調(diào)節(jié)NAD+/BDNF/TrkB 通路，減小光照血栓中風(fēng)小鼠的腦缺血面積及改善行為學(xué)功能。Yan等[51]發(fā)現(xiàn)三七皂苷Rb1可以調(diào)節(jié)Akt/mTOR/PTEN通路改善光照血栓大鼠的中風(fēng)癥狀。表2列舉了部分利用光照血栓模型進(jìn)行研究的藥物。

表2 通過(guò)光照血栓模型研究的具有抗中風(fēng)潛力的代表性藥物

4 結(jié)語(yǔ)

大腦小血管阻塞是光照血栓性中風(fēng)模型的模式特點(diǎn)。與其它中風(fēng)模型相比，其優(yōu)勢(shì)包括可以調(diào)整激光照射在特定的大腦區(qū)域內(nèi)及控制激光照射強(qiáng)度和照射時(shí)間、控制血栓形成的部位和大小、創(chuàng)傷性小、操作簡(jiǎn)單并且動(dòng)物的死亡率低。另外，該模型的中風(fēng)相關(guān)神經(jīng)功能障礙時(shí)間持續(xù)久并且穩(wěn)定，具有重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。光照血栓性中風(fēng)模型也有著一些劣勢(shì)，例如腦水腫的形成與臨床實(shí)際情況不符、缺血半暗帶的形成面積很小或者幾乎沒(méi)有、神經(jīng)功能的損傷相對(duì)其它模型輕微。綜上所述，光照血栓性中風(fēng)模型在缺血性中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)再生的細(xì)胞和分子機(jī)制研究及尋找治療中風(fēng)的潛在藥物研究中可以發(fā)揮一定的模型支撐作用。除此以外，有研究者利用此模型研究“心腦交互作用”，發(fā)現(xiàn)小鼠在中風(fēng)后免疫細(xì)胞入侵心臟，導(dǎo)致了慢性心功能不全的癥狀出現(xiàn)[61]；也有研究報(bào)道光照血栓法還可以應(yīng)用于心肌梗死及三叉神經(jīng)痛等模型的建立[62-63]。所以，盡管光照血栓模型有缺點(diǎn)和不足，但是其應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)更加的顯著。在未來(lái)的應(yīng)用中除了可以對(duì)化合物進(jìn)行應(yīng)用及研究，還可以應(yīng)用于具有神經(jīng)保護(hù)作用的具有抗中風(fēng)潛力的中藥及復(fù)方制劑的研究。作為有效的模型，除了應(yīng)用于中風(fēng)疾病模型外，也可以拓展應(yīng)用于心血管疾病的缺血模型、肝臟缺血模型、腎臟缺血模型等。光照血栓模型可以在未來(lái)相應(yīng)的機(jī)制研究和藥物開(kāi)發(fā)研究中提供有力的模型支撐。