豬德爾塔冠狀病毒研究進展

董建國，饒 丹，覃燕靈，王艷午，張 寧，易本馳，黃 立，劉紀成，鄧凱偉

（1.信陽農(nóng)林學院牧醫(yī)工程學院，河南 信陽 464000；2.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場，廣西 南寧 530000；3.河南豐源和普農(nóng)牧有限公司， 河南 駐馬店 463000）

豬德爾塔冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）是2012年新發(fā)現(xiàn)的一種感染豬的冠狀病毒[1]。冠狀病毒分為α、β、γ、δ等4個冠狀病毒屬，其中α冠狀病毒屬和β冠狀病毒屬主要由哺乳動物冠狀病毒組成，γ冠狀病毒屬主要以鳥類冠狀病毒為主，而δ冠狀病毒屬近年新分出的冠狀病毒屬，在哺乳動物和鳥類中都能檢測到。δ冠狀病毒最早在2007年從中國白鼬獾和亞洲豹貓中檢測出[2]，該類冠狀病毒基因組大小為26 396～26 552 nt，為已知最小的冠狀病毒[3]。PDCoV首次于2012年在香港從收集的豬糞便樣本中檢測到[1]。2014年初，美國俄亥俄州的豬場爆發(fā)大面積的仔豬流行性腹瀉，腹瀉癥狀以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和食欲下降為基本特征，經(jīng)檢測為PDCoV陽性，但其他腸道病毒例如豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）以及輪狀病毒（PoRV）檢測結(jié)果為陰性[4]。在美國的主要養(yǎng)豬地區(qū)也相繼檢測到了該新型豬冠狀病毒[5-7]。隨后，在韓國、加拿大豬只糞便樣品中也檢測到了PDCoV[8]。我國大陸地區(qū)于 2014 年首次報道檢測到該病毒，迄今多個省市地區(qū)的已檢測到PDCoV感染[9-10]。目前PDCoV在我國有些地區(qū)呈流行趨勢，該病的發(fā)生增加了豬只腸道病毒性疾病的危害，同時也增加了豬只腸道細菌性疾病的嚴重性，給豬場疾病的防控帶來了困難，同時造成一定的經(jīng)濟損失。為了對該病有詳細的了解，以便于疾病的深入研究和防控，我們根據(jù)近年來研究者對PDCoV的報道，從豬德爾塔冠狀病毒的基因組分析、流行現(xiàn)狀、遺傳進化分析、檢測方法及防控措施等方面進行闡述。

1 PDCoV基因組特征

PDCoV 是一種具有囊膜、單股正鏈的RNA病毒，基因組長為25.4 kb，包含5′和3′非編碼區(qū)及7個開放性閱讀框，分別編碼多聚酶蛋白1a/1b、纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、非結(jié)構(gòu)蛋白6（NS6）、核衣殼蛋白（N）及非結(jié)構(gòu)蛋白7（NS7），其中包括4個結(jié)構(gòu)基因和4個非結(jié)構(gòu)基因[1]。5′非編碼區(qū)長度為511～540 nt，主要功能是調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄。多聚酶蛋白基因全長約19 000 nt，占整個基因組的3/4，由兩個開放閱讀框（ORF）ORF1a和ORF1b組成，ORF1a和ORF1b編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab，pp1a和pp1ab進一步水解成15個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp）參與病毒復制和轉(zhuǎn)錄。

2 PDCoV蛋白功能

2.1 PDCoV非結(jié)構(gòu)蛋白功能

目前對PDCoV各蛋白功能研究較少，nsp5是3C樣蛋白酶，Zhu等[11]證實PDCoV nsp5能夠切割JAK-STAT2信號通路中的STAT2蛋白，導致STAT2降解，影響干擾素誘導基因（ISGs）的表達，進而拮抗Ⅰ型干擾素（IFN-Ⅰ），抑制先天性免疫。非結(jié)構(gòu)蛋白NS7和NS6，為PDCoV的輔助蛋白。Fang等[12]發(fā)現(xiàn)異位表達的NS6通過干擾RIG-I/MDA5與雙鏈RNA的結(jié)合可阻礙干擾素β的產(chǎn)生，揭示了PDCoV輔助蛋白所采用的一種新策略來抵抗宿主先天抗病毒免疫應(yīng)答。NS7特異性單克隆抗體（MAb）能夠識別來自PDCoV感染的細胞裂解物，但不識別NS7 異位表達的細胞，后通過實驗證明該蛋白條帶代表1個新的輔助蛋白，稱為NS7a。此外，F(xiàn)ang等還證實NS7a由獨立的亞基因組mRNA編碼，具有非經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列[13]。

2.2 PDCoV結(jié)構(gòu)蛋白功能

目前尚未有關(guān)PDCoV結(jié)構(gòu)蛋白（S、N、E和M）功能的研究報道。在其他冠狀病毒中，PEDV的S蛋白在病毒與細胞受體結(jié)合后通過膜融合侵入宿主細胞的過程中發(fā)揮重要生物學作用，N蛋白在病毒復制過程中起重要作用。TGEV和PEDV的M蛋白對構(gòu)建病毒顆粒起重要作用，還具有抗干擾素活性的功能[14-15]。PEDV的E蛋白在病毒粒子的組裝及出芽釋放到細胞外發(fā)揮重要作用[16]。PDCoV 結(jié)構(gòu)蛋白的生物學功能有待進一步研究。

3 PDCoV流行現(xiàn)狀

3.1 國內(nèi)外地區(qū)PDCoV流行情況

PDCoV可引起母豬和仔豬腹瀉癥狀，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和食欲下降為基本特征，各年齡段豬群均易感，發(fā)病仔豬中的死亡率為30%～40%[4,17]。2012年，Woo等[1]首次在香港從豬腹瀉豬糞便中檢測到PDCoV，研究顯示169份樣品中有17份樣品為PDCoV陽性。隨后，該病于2014年2月在美國俄亥俄州暴發(fā)，至今該病已經(jīng)蔓延至美國20多個地區(qū)[18]。同年6月，在加拿大安達羅湖周邊的5個豬場中檢測到PDCoV。對美國以及加拿大部分地區(qū)豬場的293份樣本進行PDCoV檢測，有30%（89/293）的樣本呈PDCoV陽性[6]。這些結(jié)果表明PDCoV在北美國家廣泛傳播，給豬場造成了巨大經(jīng)濟損失。此外，亞洲國家韓國和東南亞國家泰國均檢測到PDCoV，且泰國陽性率高達87%[19-20]。我國學者對國內(nèi)PDCoV的流行情況進行了廣泛的調(diào)查，張帆帆等對2012—2015年從江西省各地區(qū)采集的腹瀉母豬糞便及腹瀉仔豬糞便/小腸組織樣品進行檢測，結(jié)果顯示2012年的腹瀉樣品中能檢測出PDCoV，2012—2015年間江西PDCoV陽性率為31.33%（78/249）[21]。Zhai等[22]對采自廣東、海南共15個豬場390份糞便樣品進行PDCoV病原檢測，檢測陽性樣品陽性率為1.28%（5/390）。這些檢測結(jié)果表明不同地區(qū)PDCoV陽性率存在差異，PDCoV在腹瀉樣品中的檢測率可大于30%，引起仔豬死亡率為30%～40%，與PEDV相比死亡率要低些。有學者對在我國安徽、廣西、湖北和江蘇4個地區(qū)收集的215份樣本（2004—2015年）進行PDCoV檢測，發(fā)現(xiàn)樣本中14份（6.51%）呈PDCoV陽性，110份 （51.2%） 為PEDV陽性，5份（2.3%）為TGEV陽性；14份PDCoV陽性樣品中，有7份（50%）同時是 PEDV陽性，2份樣品同時是 PEDV、TGEV和PDCoV陽性，陽性樣品最早采樣時間是2004年[23]。宋亞兵等[24]對2012—2016年間采集的420份豬腹瀉病料樣品進行PDCoV抗原檢測，PDCoV陽性率為13.33%，與PEDV混合感染率為5.95%。這些結(jié)果表明PDCoV不僅單獨感染豬只，還與PEDV和TGEV混合感染，且與PEDV混合感染率較高。我國最早檢測到PDCoV樣品年份可追溯到2004年，說明該病毒很早就在我國豬群中存在卻未被發(fā)現(xiàn)。這些研究結(jié)果提示我們需要加強對PDCoV以及其他豬腸道病毒性腹瀉的長期監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)疫情加以防控，以防止疾病蔓延。

3.2 PDCoV季節(jié)流行特征

宋亞兵等[24]檢測的420份豬腹瀉病料樣品中，春、夏、秋、冬4個季節(jié)中PDCoV陽性病料樣品占比分別為35.7%、10.7%、12.5%、41.1%，表明冬春季節(jié)是該傳染病的高發(fā)季節(jié)，PDCoV的發(fā)生呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性。這是由于冬春季節(jié)氣溫變化幅度較大，出生仔豬抵抗力較弱，易產(chǎn)生應(yīng)激，造成腸道功能紊亂，導致病毒性腹瀉發(fā)生。這與PEDV、TGEV和RV等引起腹瀉的發(fā)病季節(jié)類似。因此，冬春季節(jié)應(yīng)加強該病的防控工作，及時補液，加強飼養(yǎng)，注意溫度變化對仔豬腹瀉的影響。

4 PDCoV遺傳進化分析

目前GenBank已收錄了近100條豬δ冠狀病毒全基因組的序列，來源于美國、中國、韓國、老撾、越南、泰國、日本等，系統(tǒng)發(fā)育和進化樹分析顯示這些毒株的同源性很高，遺傳進化關(guān)系非常親近，可能起源于同一毒株。其中，美國毒株與韓國毒株KOR/KNU14-04/2014的S基因核苷酸序列最接近，核苷酸同源性為99.5%～99.9%，全基因組核苷酸序列同源性為99.6%～99.9%，且沒有基因序列的插入或缺失[25]，遺傳進化樹分析發(fā)現(xiàn)美國毒株與韓國毒株KOR/KNU14-04/2014處于同一分支，表明它們可能起源于同一毒株；韓國毒株與香港毒株HKU15-44和HKU15-155存在98.8%～99.0%基因相似性，與美國毒株存在99.6%～99.8%基因相似性，這也表明韓國毒株與美國毒株親緣關(guān)系更相近[8]；中國大陸毒株（CHN-AH-2004、CHN-HB-2014和 CHNJS-2014）與先前所有報道PDCoV株的核苷酸同源性在98.9%以上。香港株HKU 15-44與美國株及韓國株在S基因上均有3 nt的插入，但香港株HKU 15-155沒有這一插入；CHN-AH-株也同樣有這個插入，然而CHN-HB-2014株和CHNJS-2014株像HKU 15-155株一樣缺少這個插入[21]。系統(tǒng)進化樹分析表明老撾BTL-0115毒株與美國及中國毒株均不在一分支上，但是與中國株親緣關(guān)系更近[26]?；谌蚪M的遺傳進化分析表明，2014年在日本檢測到的7株P(guān)DCoV毒株與2013—2016年美國和韓國分離的毒株的基因相似性一致[27]。表明不同地區(qū)PDCoV已經(jīng)發(fā)生廣泛的變異，且變異主要集中在S基因上。因此，及時開展針對PDCoV S基因的遺傳變異分析，分析突變堿基對病毒致病性的影響，對于研發(fā)有效的疫苗防控該病具有重要意義。

5 PDCoV檢測方法

5.1 抗原檢測方法

PDCoV引起的臨床癥狀和病理變化與豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎相似，一般很難通過肉眼觀察辨別，需要借助實驗室診斷方法確診。在病原檢測方面，借助電子顯微鏡，可以觀察到病毒超微結(jié)構(gòu)形態(tài)，PDCoV在電鏡下呈球型帶囊膜的顆粒，直徑120～180 nm[17]，結(jié)合病豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀進行診斷。RT-PCR是檢測病毒核酸常用的方法之一，除了傳統(tǒng)的RTPCR外還有套式RT-PCR、實時熒光定量PCR、多重RT-PCR以及恒溫RT-PCR等。由于PDCoV的N基因和M基因高度保守，大部分的RT-PCR檢測技術(shù)都是針對這兩個基因建立的。張帆帆等[22]設(shè)計1對擴增PDCoV核衣殼（N）蛋白基因片段的特異性引物，建立了一種檢測PDCoV的RT-PCR方法。逄鳳嬌等[28]根據(jù)保守的M 基因建立了RT-PCR 的檢測方法。此外，針對PDCoV與PEDV和TGEV混合感染情況，也建立了一系列的多重PCR檢測方法。劉玲玲等[29]建立了檢測PDCoV和TGEV的雙重RT-PCR檢測方法；任玉鵬等[30]建立了同時檢測PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法；Song等[10]根據(jù)N基因設(shè)計內(nèi)套和外套兩對引物，在中國大陸首次建立套式PCR技術(shù)，完成了PDCoV感染情況調(diào)查并率先報道了1株 PDCoV全基因序列。熒光定量PCR技術(shù)作為一種新的PCR技術(shù)，具有檢測靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，受到了廣泛的應(yīng)用。Marthaler等[6]建立了基于SYBR green染料法的實時熒光定量檢測方法，檢測豬群中PDCoV感染情況，并同時檢測了其他腹瀉相關(guān)病原，發(fā)現(xiàn)豬群中存在不同程度的混合感染；Wang等[31]建立實時熒光定量PCR用于臨床樣品的檢測，對2014—2015年中國10個省份收集的254份樣品進行檢測，檢測陽性率為4.33%。此外，Masuda等[32]建立了可同時檢測PEDV、PDCoV、TGEV、PRV 等4種腹瀉相關(guān)病原的四重實時熒光定量PCR，檢測靈敏度比普通RT-PCR方法高1 000倍。LAMP具有方便、快速和靈敏等優(yōu)點，Zhang等[33]建立了檢測PDCoV的RT-LAMP方法，對比檢測192份臨床樣品，該方法檢測靈敏度高于套式PCR和常規(guī)RT-PCR。由此可見，PDCoV抗原的PCR檢測方法國內(nèi)外都已有很多報道，不僅有針對PDCoV的單重RT-PCR和熒光定量PCR檢測方法，還有針對各類引起豬腹瀉病毒的多重RT-PCR和熒光定量PCR檢測方法，這為病毒的檢測提供了很便利的方法參考。

5.2 抗體檢測方法

在檢測抗體方面，近年來也有許多關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光試驗（IFA）等的報道。Faten等[34]通過表達N基因的重組蛋白建立了檢測抗體的間接ELISA方法、熒光微球免疫技術(shù)（FMIA）和間接IFA技術(shù)，檢測敏感性和特異性均達95%以上。Luo等[35]基于M基因表達的重組蛋白建立的間接ELISA方法，檢測敏感性和特異性分別為90.6%和93.3%，通過對河北省40個豬場共871份血清進行監(jiān)測，結(jié)果顯示血清抗體陽性率為11%（96/871），陽性豬場率為25%（10/40）。Thachil等[7]建立了一種間接抗PDCoV IgG ELISA方法，該方法是基于S1部分的刺突蛋白而建立的，檢測敏感性和特異性分別為91%和95%，血清抗體陽性率為8.7%，陽性豬場率為25.5%，該報道還發(fā)現(xiàn)PDCoV抗體陽性率低于PEDV陽性率（22.8%）。這些抗體檢測方法的建立為及時掌握豬場豬體內(nèi)PDCoV抗體水平，全面反映畜群中疾病的感染情況、免疫水平、流行特點等提供重要的科學依據(jù)。

6 PDCoV防控措施

引起豬病毒性腹瀉的病原有PEDV、TGEV、PoRV、豬偽狂犬病病毒（PRV）及PDCoV等，但目前尚無針對PDCoV的商品疫苗，且對于采用干擾素、雞卵黃抗體等特異性抗病毒治療的報道也較少。

病毒性腹瀉病原可以是一種或多種，這樣就使得實際診斷復雜化，需要借助實驗室的一些診斷方法。對于腹瀉豬需要科學地進行護理，如對腹瀉豬進行收斂止瀉、補液和糾正酸中毒的治療，都能減少患豬的死亡。防控病毒性腹瀉首先應(yīng)加強飼養(yǎng)管理。通過給予飼喂營養(yǎng)豐富的全價飼料以提高機體的免疫力與抗病力；保持豬舍清潔衛(wèi)生和干燥，嚴格舍內(nèi)消毒和周邊環(huán)境的消毒，冬季寒冷季節(jié)注意保溫，產(chǎn)房和保育舍保持適宜溫度和濕度，適當通風換氣；建立完善的生物安全體系，場內(nèi)外車輛、人員、物料、豬等的轉(zhuǎn)移需嚴格把控。PDCoV主要引起仔豬的腹瀉，重點防控對象為哺乳仔豬與保育豬，該病沒有相關(guān)有效的疫苗進行預防，疾病發(fā)生時主要是補液補鹽，同時防止激發(fā)感染，再者需要做好豬舍的消毒工作和應(yīng)激工作，具體防控措施可參照同樣由冠狀病毒引起的豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎的防控方法。

7 展望

近幾年豬場腸道性疾病不斷發(fā)生，特別是近年來引起相似癥狀的與PDCoV同科的變異毒株P(guān)EDV的爆發(fā)，引起了研究者和飼養(yǎng)人員的注意，隨著各種豬腸道病毒性腹瀉病的發(fā)生，外界環(huán)境的復雜和仔豬體抗力的下降，越來越多的豬場相繼爆發(fā)PDCoV，給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的危害和經(jīng)濟損失。目前針對PDCoV病毒蛋白如何調(diào)控宿主機能，利用宿主機制逃避免疫反應(yīng)，利于病毒自身存活和增殖的研究較少。PDCoV有許多非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復制和轉(zhuǎn)錄中具有重要作用，它們的具體功能如何，是否有與免疫調(diào)控相關(guān)的病毒蛋白存在，能否根據(jù)這些與免疫調(diào)控相關(guān)的病毒蛋白研制新型亞單位疫苗，通過病毒自身蛋白直接調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)進而對疾病本身進行預防；同時遺傳變異分析顯示S基因容易發(fā)生變異，存在堿基的插入或缺失，這些堿基的插入或缺失是否影響病毒毒力，是否與中和抗體的水平變化呈線性相關(guān)，隨著研究的深入，相信研究者在這方面會有詳細的闡述。