根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及其在稻瘟病菌中的應(yīng)用

何麗云，張樹林，崔百元，朱慶鋒，劉圣杰，劉文華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣東 廣州 510640）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球半數(shù)以上人口以大米為主食。在我國，水稻種植面積達(dá)3 000 萬hm2，約占所有糧食作物種植面積的27%，年均總產(chǎn)量占世界稻谷總產(chǎn)量的35.3%，居世界首位[1]。由稻瘟病菌〔Magnaporthe oryzae，無性態(tài)：Pyricularia grisea （Cooke） Sacc〕引起的稻瘟病是一種世界性的水稻病害，它與白葉枯病、紋枯病并稱為水稻三大病害。至今，已有85個國家報道有稻瘟病發(fā)生，全球每年由該病害造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)10%～35%，經(jīng)濟損失達(dá)數(shù)十億美元[2-3]。除侵染水稻外，稻瘟病菌也能侵染并危害其他重要的谷類作物，如小麥、小米、高粱、黑麥和玉米等，因此稻瘟病菌被認(rèn)為是世界上最重要的植物病原真菌[4]。此外，稻瘟病菌由于其具有廣泛的遺傳和分子變異性，且與水稻間的相互作用符合基因?qū)蜿P(guān)系，現(xiàn)已成為研究植物-病原菌互作機制的模式病原菌之一。隨著全基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)以及高通量測序策略的后續(xù)應(yīng)用已成功地為超過50個稻瘟病菌分離株做了基因組測序[5]，稻瘟病菌的生物學(xué)研究進(jìn)入了功能基因組學(xué)時代。因此，研究基因功能，特別是效應(yīng)子基因功能，在解釋稻瘟病菌的致病機制和生理特性，以及對稻瘟病的防治等方面具有重要的理論和實踐意義。遺傳轉(zhuǎn)化作為一種重要的基因功能研究的輔助手段，可以實現(xiàn)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，進(jìn)而研究該目的基因的功能。

目前，實現(xiàn)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法包括CaCl2-PEG轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、基因槍法、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法REMI以及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）因操作方便，轉(zhuǎn)化效率高及重復(fù)性好等特點而被廣泛應(yīng)用。自Bundock等[6]首次應(yīng)用ATMT技術(shù)成功實現(xiàn)了對釀酒酵母的高效轉(zhuǎn)化，隨后，Groot等[7]利用ATMT技術(shù)對6種絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，這項技術(shù)便得到迅速發(fā)展。目前，利用該方法成功轉(zhuǎn)化的真菌已近100種[8]。2001年，Rho等[9]首次利用ATMT技術(shù)成功實現(xiàn)了對稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化，為稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個重要工具。本文對ATMT技術(shù)的轉(zhuǎn)化原理、特點、步驟、影響因素以及該方法在稻瘟病菌功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期能夠為稻瘟病菌等真菌的遺傳轉(zhuǎn)化方面研究提供相關(guān)的參考。

1 ATMT技術(shù)的轉(zhuǎn)化原理和特點

1.1 轉(zhuǎn)化原理

ATMT是一種依據(jù)農(nóng)桿菌能夠侵染植物的特點將外源基因?qū)胫参锘蚪M中使目的基因表達(dá)的方法，它最初被應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)基因研究中。根癌農(nóng)桿菌屬于革蘭氏陰性土壤桿菌，它能將自身Tumor - inducing（Ti）質(zhì)粒的一段 DNA（T-DNA）經(jīng)傷口轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，從而使植物損傷部位形成冠癭瘤。由于T-DNA在轉(zhuǎn)化過程中不受序列特異性的影響，因此可借助分子克隆技術(shù)將內(nèi)源的T-DNA替換成外源基因來完成遺傳轉(zhuǎn)化，最終得到可以表達(dá)外源基因的植物或真菌[10]。已有研究表明，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌等絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的機理與其介導(dǎo)植物的遺傳轉(zhuǎn)化相類似，都包括農(nóng)桿菌在宿主細(xì)胞上的吸附，Ti質(zhì)粒上的Vir基因的激活，T-DNA切割、包裝、轉(zhuǎn)移和加工等過程[11]。

在實驗過程中，通常利用一些酚類化合物，如乙酰丁香酮（AS），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上Vir基因的表達(dá)，合成T-DNA轉(zhuǎn)移所需的一些蛋白質(zhì)。VirA和VirG是Vir基因表達(dá)的主控基因，VirA被酚類物質(zhì)激活后自動磷酸化并使VirG磷酸化，從而激活其他Vir基因的轉(zhuǎn)錄，合成用于編碼T-DNA加工、轉(zhuǎn)移和整合的功能蛋白[12]。所以，Vir基因的活化是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的開關(guān)，當(dāng)酚類物質(zhì)濃度過高或者導(dǎo)致Vir基因誘導(dǎo)物減少時會對農(nóng)桿菌產(chǎn)生毒害作用，不利于T-DNA的進(jìn)入或整合[11]。

1.2 轉(zhuǎn)化特點

1.2.1 轉(zhuǎn)化受體多樣性 相比于傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，如PEG-CaCl2法、醋酸鋰法、基因槍法等，ATMT技術(shù)最明顯的優(yōu)點就是其轉(zhuǎn)化受體的多樣性。它除了可以利用原生質(zhì)體作為初始材料外，還可以利用分生孢子，菌絲體和子實體組織等作為受體，突破了原來僅依靠原生質(zhì)體完成遺傳轉(zhuǎn)化的局限性，使得整個轉(zhuǎn)化過程方便，易于操作。因此對一些難以制備原生質(zhì)體的真菌來說，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法是一個較好的選擇。姜寧等[13]以香菇的孢子單核體、原生質(zhì)體單核體和雙核體菌株為轉(zhuǎn)化受體，均獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的香菇轉(zhuǎn)化菌株。2001年，Rho等[9]首次利用ATMT系統(tǒng)成功地實現(xiàn)了對稻瘟病菌孢子的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.2 轉(zhuǎn)化高效性 與絲狀真菌的其他轉(zhuǎn)化方法相比，ATMT法轉(zhuǎn)化效率明顯提高，可達(dá)到300～7 200個轉(zhuǎn)化子/107個細(xì)胞，是傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化方法的 100～1 000 倍[7，14]。Meyer等[15]研究表明，利用ATMT技術(shù)轉(zhuǎn)化Aspergillus giganteus的分生孢子，其轉(zhuǎn)化效率比PEG法高140倍。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性高 選擇單核的分生孢子作為ATMT轉(zhuǎn)化的初始材料，獲得的轉(zhuǎn)化子相比于其他方法，其轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性更高。M.purpureus的ATMT轉(zhuǎn)化子經(jīng)4輪孢子培養(yǎng)及篩選后，98%的轉(zhuǎn)化子仍然具有潮霉素抗性，而利用PEG方法獲得的轉(zhuǎn)化子，只有60%的轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出對潮霉素具有抗性[16]。在Agaricus bisporus的50個ATMT轉(zhuǎn)化子中，經(jīng)過5輪孢子的培養(yǎng)及篩選后，其中42個轉(zhuǎn)化子仍然表現(xiàn)出對潮霉素的抗性，穩(wěn)定性高達(dá)85%[17]。

1.2.4 T-DNA單拷貝插入比例較高 ATMT的非同源轉(zhuǎn)化，通常使T-DNA以單拷貝形式整合到受體菌株的染色體上。研究表明，ATMT法轉(zhuǎn)化的突變體90%以上都是DNA插入引起的[18]，通過隨機挑選12個稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子，其中8個為單拷貝插入，單拷貝插入頻率達(dá)到66%，而REMI方法轉(zhuǎn)化的Glomerella graminicola突變體DNA 插入不到20%[19]。Guo等[20]通過PCR擴增和Southern雜交表明，在隨機選擇的56個稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子中，96%的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子都為單拷貝插入。

ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)也存在一定的缺點，主要表現(xiàn)在：（1）有時仍會出現(xiàn)多拷貝插入，給表型分析和基因分離造成困難；（2）工作量大，建立基因組范圍的飽和突變，需要的突變體數(shù)量極大，以稻瘟病菌為例，理論上要建立一個飽和的水稻稻瘟病菌突變體庫要3萬～4萬個突變體；（3）受寄主范圍限制。

2 ATMT轉(zhuǎn)化稻瘟病菌的步驟

2.1 雙元載體的構(gòu)建及工程菌株的制備

進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實驗，首先需要構(gòu)建符合實驗?zāi)康牡碾p元載體。雙元載體上需攜帶適合真菌啟動子和終止子的抗性篩選標(biāo)記基因，如潮霉素B基因。通過設(shè)計合適的引物擴增獲得目的基因片段，再利用酶切和連接的方法，使目的基因片段插入到T-DNA的左、右邊界之間。構(gòu)建好的雙元載體可通過凍融法或電擊轉(zhuǎn)化法等方法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，從而獲得攜帶外源基因的工程菌株。

2.2 工程菌株的培養(yǎng)與處理

從LB平板上挑取含有雙元載體的農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于50 mL含有合適抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取出培養(yǎng)物，按照1∶100比例重懸菌體于IM+AS液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4～6 h，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌OD600為0.3～0.5左右，作轉(zhuǎn)化供體備用。

2.3 稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)與制備

稻瘟病菌接種在米糠或燕麥培養(yǎng)基上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)10 d左右，促使其產(chǎn)孢。孢子培養(yǎng)后在培養(yǎng)基中加入5 mL滅菌蒸餾水，用無菌刮勺輕刮洗干菌體表面，洗下孢子，用兩層滅菌擦鏡紙過濾收集孢子。

2.4 共培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

將上述農(nóng)桿菌液與孢子液等體積混合，取150 μL混合液均勻涂布在鋪有硝酸纖維濾膜或微孔濾膜并含有AS的IM固體培養(yǎng)基上，22～25 ℃暗培養(yǎng)2～3 d后，將上述膜用無菌剪刀剪成0.5 cm條狀，正向貼于含有潮霉素B，頭孢霉素和羧芐青霉素的篩選培養(yǎng)基CM上，條與條之間留出適當(dāng)距離，便于轉(zhuǎn)化子的生長。28 ℃下培養(yǎng)4～7 d后挑取轉(zhuǎn)化子至新的篩選培養(yǎng)基上。最后，對獲得的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，通過PCR擴增和Southern雜交來鑒定篩選疑似轉(zhuǎn)化子以及插入T-DNA的拷貝數(shù)。

3 影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的主要因素

3.1 乙酰丁香酮AS的濃度

許多研究表明，在ATMT轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)階段需要加入AS來誘導(dǎo)Vir基因的表達(dá)，因此AS的濃度是整個轉(zhuǎn)化過程中最關(guān)鍵的影響因素。在共培養(yǎng)階段，通常AS濃度與ATMT轉(zhuǎn)化效率之間呈現(xiàn)出一個單峰型曲線的關(guān)系，最適濃度為200～300 μmol/L。例如在對芽枝霉菌Cladosporium cladosporioides進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，AS的最適濃度為300 μmol/L[21]；在轉(zhuǎn)化淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus和香蕉枯萎菌時，AS濃度高于200 μmol/L時，轉(zhuǎn)效率較高，但過高的濃度反而會影響轉(zhuǎn)化效率[22-23]。但在根癌農(nóng)桿菌的預(yù)培養(yǎng)過程中是否一定需要加入AS還未形成定論。例如，在轉(zhuǎn)化在球狀白僵菌，尖孢鐮刀菌時，預(yù)培養(yǎng)階段不加入AS，會顯著地影響轉(zhuǎn)化效率[24-25]。然而，也有研究表明，預(yù)培養(yǎng)階段不需要額外AS的加入也可完成轉(zhuǎn)化過程[26-28]。因此，在對一種新的真菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實驗時，需要在預(yù)培養(yǎng)階段對AS的加入與否以及共培養(yǎng)階段AS最佳濃度進(jìn)行探索，以提高轉(zhuǎn)化效率。針對稻瘟病菌而言，利用ATMT系統(tǒng)對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，無論是預(yù)培養(yǎng)階段，還是共培養(yǎng)階段，都需要AS的誘導(dǎo)，且當(dāng)AS濃度在200 μmol/L時轉(zhuǎn)化效率最高[29]。

3.2 共培養(yǎng)溫度和時間

共培養(yǎng)溫度和時間是影響ATMT轉(zhuǎn)化的兩個重要因素。根癌農(nóng)桿菌侵染完成需要在合適的溫度下，經(jīng)過一定的時間，才能完成轉(zhuǎn)化，溫度過高或過低，篩選過早或過晚，都不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。Sharma等[27]在白腐菌Phanerochaete chrysosporium的ATMT轉(zhuǎn)化過程中，設(shè)置20、23、26、29 ℃4個共培養(yǎng)溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 ℃時轉(zhuǎn)化效率最高，29 ℃時轉(zhuǎn)化完全失敗。Wang等[30]對土曲霉菌Aspergillus terreus轉(zhuǎn)化時，分別比較了22、25、28 ℃對轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)在25 ℃培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率最高，可以達(dá)到350個轉(zhuǎn)化子/106個孢子。Liu等[31]在葉斑病菌Curvularia lunata的ATMT轉(zhuǎn)化時，設(shè)置4個溫度梯度（19、22、25、28 ℃）及2個共培養(yǎng)時間（24、48 h），結(jié)果表明在19～25 ℃區(qū)間內(nèi)，在這2個共培養(yǎng)時間條件下，轉(zhuǎn)化子均隨著溫度升高而增加，但當(dāng)溫度為28 ℃時，2個共培養(yǎng)時間獲得轉(zhuǎn)化子的數(shù)量非常少，最終確定最適共培養(yǎng)時間和溫度為48 h和25 ℃。目前有學(xué)者認(rèn)為ATMT介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化所需溫度為22～25 ℃，但事實上不同的真菌其溫度并非都在此范圍內(nèi)[32]。

根癌農(nóng)桿菌和真菌都需要在合適的溫度下生存，其轉(zhuǎn)化所需要的酶也只能在特定的溫度下催化效率最高，因此在具體的研究過程中，需要自己探索出合適的溫度。共培養(yǎng)的時間過短，得到的轉(zhuǎn)化子較少，不利于后續(xù)的實驗；共培養(yǎng)時間過長，會使插入的T-DNA拷貝數(shù)增加，并且潮霉素抑制效果會減弱，產(chǎn)生背景干擾，導(dǎo)致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)。例如，地衣真菌Umbilicaria muehlenbergii遺傳轉(zhuǎn)化時，相比于24 h或36 h的培養(yǎng)時間，48 h獲得的轉(zhuǎn)化子增加64倍，達(dá)到27～98個轉(zhuǎn)化子/106個孢子，但是長時間的共培養(yǎng)使得單拷貝T-DNA插入的頻率下降10%～15%[33]。針對稻瘟病菌，張俊華等[34]發(fā)現(xiàn)，ATMT轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)最適溫度為28 ℃，共培養(yǎng)時間為4 d，這與之前吳毅歆等[35]的研究結(jié)果類似；而在Rho等[9]的研究中，其ATMT轉(zhuǎn)化采用的共培養(yǎng)時間為48 h，最適溫度為22 ℃，這可能是與他們采用的農(nóng)桿菌菌株及稻瘟病菌菌株的類型不同有關(guān)，前者所采用的農(nóng)桿菌為C58C1，稻瘟病菌為CY2，而后者采用的農(nóng)桿菌為AGL-1，稻瘟病菌為70-15。

3.3 農(nóng)桿菌菌株類型

在ATMT轉(zhuǎn)化過程中，轉(zhuǎn)化效率也受根癌農(nóng)桿菌菌株類型的影響。目前較為常用的農(nóng)桿菌菌株有5種，分別是EHA105、AGL-1、LBA1100、LBA4404和C58C1，在不同真菌轉(zhuǎn)化過程中，所使用的菌株也不同。Lu等[36]對玉米灰斑病菌Cercospora zeae-maydis進(jìn)行ATMT轉(zhuǎn)化時，比較了AGL-1、LBA4404和EHA105菌株的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGL-1的轉(zhuǎn)化效率最高，分別為LBA4404菌株的4倍、EHA105菌株的2倍。在青霉菌Penicillium chrysogenum的ATMT轉(zhuǎn)化時，AGL-1菌株的轉(zhuǎn)化效率要比LBA1100菌株高出 2～3 倍[37]。Liu 等[38]在進(jìn)行紫杉醇產(chǎn)生菌Ozonium sp.EFY21的轉(zhuǎn)化時，發(fā)現(xiàn)EHA105菌株的效率最高，而AGL-1和LBA4404菌株的轉(zhuǎn)化很少成功甚至得不到轉(zhuǎn)化子。因此，不同真菌的ATMT轉(zhuǎn)化對農(nóng)桿菌菌株具有一定的選擇性，在具體的實驗過程中需要進(jìn)行探索找到合適的農(nóng)桿菌菌株。目前在稻瘟病菌的ATMT轉(zhuǎn)化中，常用的農(nóng)桿菌菌株有AGL-1、C58C1和EHA105，針對這3種農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率比較研究尚未見報道。

3.4 真菌受體與農(nóng)桿菌的濃度

在一定范圍內(nèi)，隨著真菌受體和農(nóng)桿菌濃度的增加，ATMT轉(zhuǎn)化效率也會提高。如Zhang等[39]對蘆筍莖枯病菌Phomopsis asparagi的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)孢子濃度在103～106CFU/mL范圍內(nèi)，農(nóng)桿菌的OD600值為0.2～0.5時，轉(zhuǎn)化效率隨著真菌濃度和農(nóng)桿菌增加轉(zhuǎn)化效率也隨之增加，但當(dāng)真菌濃度提高到107CFU/mL時，或農(nóng)桿菌OD600值為0.6時，其轉(zhuǎn)化效率反而顯著下降。Wang等[40]進(jìn)行蘋果腐爛菌的遺傳轉(zhuǎn)化時，當(dāng)真菌包子濃度為106CFU/mL時，其轉(zhuǎn)化效率最高。李敏慧等[23]在對稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化時，當(dāng)孢子濃度為106CFU/mL、農(nóng)桿菌的OD600值為0.4時，其轉(zhuǎn)化效率最高。Rho等[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)疚敛【咦訚舛群娃r(nóng)桿菌濃度比值為1∶2時，ATMT的轉(zhuǎn)化效率最高。總之，在轉(zhuǎn)化過程中，當(dāng)農(nóng)桿菌濃度過高時，農(nóng)桿菌會與孢子搶占營養(yǎng)，影響孢子萌發(fā)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降。同樣，當(dāng)孢子濃度過高時則會導(dǎo)致真菌的過量生長，影響后期轉(zhuǎn)化子的篩選及單克隆轉(zhuǎn)化子的挑取。因此，針對不同類型的真菌，其ATMT轉(zhuǎn)化的真菌和農(nóng)桿菌的最佳濃度也不同，在具體的研究中，需要對二者的濃度進(jìn)行探索，進(jìn)而獲得最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。

4 ATMT在稻瘟病菌功能基因組學(xué)中的應(yīng)用

4.1 建立T-DNA插入突變體庫

在稻瘟病菌功能基因組學(xué)研究中，突變體庫的容量是開展其基因組學(xué)研究的前提。建立突變體庫需要高效的轉(zhuǎn)化體系，外源標(biāo)記能夠單拷貝隨機插入真菌基因組中。利用ATMT法建立稻瘟病菌T-DNA插入突變體庫，豐富的突變體為突變基因的篩選和致病機理的研究提供了良好的平臺。Li等[41]利用ATMT法獲得含6 179個轉(zhuǎn)化子的稻瘟病菌T-DNA隨機插入的突變體庫，通過Tail-PCR擴增，獲得623個右側(cè)翼序列和124個左側(cè)翼序列，對這些序列分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA的插入與染色體重排有關(guān)，且與植物相比其插入模式更精確更單一。Chen等[42]構(gòu)建了容量為70 000個轉(zhuǎn)化子的稻瘟病菌突變體庫，利用Tail-PCR擴增T-DNA左右側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)其中1個轉(zhuǎn)化子SX11404插入了2個假定基因MGG_01597.5和MGG_11181.5。吳毅歆等[35]構(gòu)建了含8 000個轉(zhuǎn)化子的稻瘟病菌突變體庫，通過接種鑒定轉(zhuǎn)化子的致病性，獲得了20個致病突變體。Jeon J等[43]對構(gòu)建的稻瘟病菌突變體庫通過高通量表型和基因型的篩選，利用Tail-PCR得到741個T-DNA標(biāo)記位點，并發(fā)現(xiàn)了202個新的致病位點。探索更有效的篩選基因突變體的方法，建立高效率的突變體庫，是今后稻瘟病菌功能基因組學(xué)研究的一項重要基礎(chǔ)工作。

4.2 目的基因的敲除或定點突變

研究基因功能最直接方式就是對該基因進(jìn)行基因敲除。將一段目的基因的同源片段連接在T-DNA內(nèi)部的兩側(cè)翼，構(gòu)建目的基因的打靶載體，然后利用ATMT轉(zhuǎn)化法，實現(xiàn)對該目的基因的定向失活，得到突變體，再根據(jù)表型變化對該基因進(jìn)行功能鑒定。Peng等[44]利用ATMT法，獲得稻瘟病菌MoDUO1敲除突變體，突變體的營養(yǎng)生長和分生孢子形態(tài)都有著明顯的缺陷，接種水稻后，僅觸發(fā)微小的病變，從而表明MoDUO1是稻瘟病菌發(fā)揮毒性所必需的。Wang等[45]敲除稻瘟病菌致病基因MoCPS1獲得的突變菌株ΔMocps1，發(fā)現(xiàn)該突變菌株的產(chǎn)孢能力明顯下降，僅有野生型的20%，且其孢子的長度和寬度都顯著不同于野生型，證明了MoCPS1在稻瘟病菌的產(chǎn)孢過程和分生孢子形態(tài)發(fā)生中具有重要作用。Mogga等[46]對稻瘟病菌效應(yīng)子MoHEG16敲除后發(fā)現(xiàn)，突變菌株在附著胞形成階段受阻且菌絲的定殖量明顯降低，證明該效應(yīng)子是稻瘟病菌早期侵染階段所必需的。Guo等[20]以Guy11為受體菌株，構(gòu)建了單個氨基酸替換H245L的突變菌株Mosdi1，與野生型相比，該突變菌株對農(nóng)藥萎銹靈具有高度抗性。Zhang等[47]通過構(gòu)建稻瘟病菌無毒基因AvrPib的單突變或雙突變以及缺失突變等14種突變體，接種鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子的插入以及編碼區(qū)的缺失均導(dǎo)致該基因喪失其無毒性功能，由此闡明了AvrPib等位基因遺傳多樣性產(chǎn)生的分子機制。

4.3 標(biāo)記和克隆相關(guān)基因

ATMT法產(chǎn)生的T-DNA插入突變子不僅能穩(wěn)定遺傳，而且大多數(shù)以單拷貝形式整合進(jìn)基因組，基因組DNA不會發(fā)生重排和切斷現(xiàn)象，這些為高效地獲得標(biāo)記突變體、分離、克隆相關(guān)基因提供了嶄新的途徑。例如，吳小燕等[48]利用ATMT法對稻瘟病菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得一株致病性增強菌株B11，利用Tail-PCR法獲得了T-DNA插入序列，并成功克隆了相關(guān)基因MgThiJ1，對該基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該基因可能參與稻瘟病菌菌絲生長及病斑擴展過程，并且具有一定的負(fù)調(diào)控作用?？椎さ49]利用該法獲得一個稻瘟病菌KD-560突變體，通過表型鑒定，該突變體不能侵染大麥及水稻葉片，采用hiTAIL-PCR的方法擴增了T-DNA右邊界的序列，成功地克隆了相關(guān)基因MoCYP537A3。

5 展望

近20年來，ATMT作為一種重要的遺傳轉(zhuǎn)化工具，它能夠?qū)⒍鄠€基因共同轉(zhuǎn)化到真菌細(xì)胞中，目前已被應(yīng)用于由鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas系統(tǒng)所介導(dǎo)的真菌基因組編輯中。尤其是近年來興起的CRISPR/Cas基因組編輯系統(tǒng)，作為一種新的基因功能研究利器，但ATMT仍然是CRISPR/Cas基因編輯后期實現(xiàn)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的重要的工具。雖然全面確定真菌中的基因功能，最終發(fā)掘這些基因的潛在意義，這一目標(biāo)短期內(nèi)難以實現(xiàn)，但ATMT在定義眾多不同性狀背后的遺傳基礎(chǔ)方面卻取得了許多里程碑式的進(jìn)展，而且它將繼續(xù)為我們對真菌生物學(xué)的研究發(fā)揮重要的作用。目前，ATMT在很多新的真菌中實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，各種真菌的基因組突變體庫的構(gòu)建取得很大的進(jìn)展，這些問題的解決有利于深入的研究致病基因的功能。然而，目前對于該技術(shù)的報道都較為基礎(chǔ)，多數(shù)涉及的是對轉(zhuǎn)化條件的摸索，而對進(jìn)一步的相關(guān)基因的篩選及功能驗證較少。

ATMT對稻瘟病菌的生物學(xué)研究有兩個重要的貢獻(xiàn)：一方面是通過篩選數(shù)以萬計的T-DNA插入突變體進(jìn)行正向遺傳學(xué)分析；另一方面是建立基因替換菌株，然后在植物上進(jìn)行致病性測試。這兩方面的研究都是闡明稻瘟病菌致病機理的重要步驟，所以在具體的研究中，我們有必要建立稻瘟病菌完善、高效的ATMT轉(zhuǎn)化方法，充分的發(fā)揮該方法的優(yōu)點，徹底的弄清稻瘟病菌致病相關(guān)基因的功能，推進(jìn)水稻抗性品種的培育進(jìn)程。雖然，目前對ATMT轉(zhuǎn)化的機制研究相對清晰，但轉(zhuǎn)化成功與否仍受多方面因素的影響，這就要求研究者對其條件進(jìn)行探索，本綜述詳細(xì)分析了ATMT轉(zhuǎn)化中的影響因素，可以為未來的研究者提供一定的參考。