植物熱激蛋白響應(yīng)非生物脅迫研究進(jìn)展

李廣隆，劉思言，魯中爽，么夢(mèng)凡，李遠(yuǎn)強(qiáng)，關(guān)淑艷，姚 丹，曲 靜

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

非生物脅迫（干旱、鹽堿、高低溫以及重金屬離子等）對(duì)植物在不同生長(zhǎng)階段都具有很大的負(fù)面影響，擾亂植物的正常生理代謝過(guò)程和細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響植物光合作用、蒸騰作用[1-2]。農(nóng)作物的減產(chǎn)很大程度上歸因于異常的自然氣候、土地鹽堿化、農(nóng)藥及化肥的過(guò)量使用、工業(yè)廢水的隨意排放等非生物脅迫，提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展中尤為重要[3]。

植物熱激蛋白（Hsps）是在植物遭遇非生物脅迫時(shí)，激活并能大量產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)。Hsps具備以下特征：（1）保守性較高，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的生物體內(nèi)同一家族的Hsps同源性高，但非同一家族的Hsps無(wú)明顯同源性；（2）具有短時(shí)性，當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，Hsps會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)積累，參與脅迫應(yīng)答；（3）種類豐富，在線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中都有定位，存在于不同細(xì)胞器中的Hsps具有不同的生物學(xué)功能，既可以獨(dú)特發(fā)揮，又能與其他蛋白協(xié)同互作[4-5]。

植物中Hsps比其他生物更加豐富和多樣化，結(jié)構(gòu)保守的Hsps具有分子伴侶的功能，通過(guò)輔助蛋白質(zhì)的折疊、組裝、易位和降解，來(lái)維持蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定，保護(hù)植物正常生長(zhǎng)具有積極作用[6]。在脅迫條件下，Hsps能幫助故障蛋白質(zhì)重新折疊，恢復(fù)正常的蛋白質(zhì)構(gòu)象并因此維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，對(duì)保護(hù)植物在非生物脅迫中免受損害起著至關(guān)重要的作用[7]。Hsps種類繁多，基因功能覆蓋廣泛，在植物抗旱方面作用明顯，同時(shí)在抗寒、抗鹽堿、抗氧化等非生物脅迫中也起到相關(guān)作用，是作物分子育種的一類良好研究對(duì)象，深入了解該蛋白有利于轉(zhuǎn)基因育種及新種質(zhì)的創(chuàng)新。

1 熱激蛋白概述

1962年意大利科學(xué)家Ritossa對(duì)高溫環(huán)境下的果蠅唾液腺進(jìn)行研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白[8]。1974年Tissieres將這種能被熱激條件刺激而合成的蛋白正式命名為熱激蛋白[9]。1992年Horwitz提出熱激蛋白屬于分子伴侶的一種[10]。所謂分子伴侶就是一類能介導(dǎo)其他多肽正確折疊，在某些情況下可暫時(shí)與其他蛋白結(jié)合，但不成為最終的功能結(jié)構(gòu)，可防止蛋白有害積累的蛋白家族。熱激蛋白的分子伴侶作用有助于提高植物對(duì)脅迫的耐受力[11-12]。在隨后對(duì)熱激蛋白的研究中，多以動(dòng)物材料為主，植物中熱激蛋白的研究起步較晚，尤其是在高等植物方面，但進(jìn)展速度較快，目前已經(jīng)在大豆（Glycine max L.）、草莓（Fragaia ananassa Duchesne）、大麥（Hordeum ulgare L.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中克隆得到了多種熱激蛋白基因[12-13]。

幾乎所有的生物體內(nèi)都有Hsps的存在，且高度保守。正常條件下的Hsps含量低于蛋白總量的5%，但在外界環(huán)境不利條件下，尤其是熱脅迫刺激時(shí)會(huì)大量合成，約占蛋白總量的15%[14-15]。Hsps有不同的分類方式，根據(jù)其分子量大小可以分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小熱激蛋白（small heat shock proteins, sHsps或Hsp20），其中高等植物中含有多達(dá)20～40種sHsps[16]。Hsps不僅參與植物對(duì)熱脅迫的響應(yīng)，還廣泛的參與其他環(huán)境脅迫，例如水脅迫、鹽度和滲透、冷和氧化脅迫[17-18]。不同類別及定位在各細(xì)胞器中的Hsps相互作用，參與不同的細(xì)胞機(jī)制。同時(shí)Hsps發(fā)揮著分子伴侶的生物學(xué)功能，在保護(hù)植物免受脅迫和重建細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[19-21]。

2 熱激蛋白生物學(xué)功能

2.1 Hsp60家族

Hsp60最初是被用來(lái)描述一類進(jìn)化上與大腸桿菌GroEL同源的分子伴侶，是在原核生物和真核生物的線粒體與質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)的一類分子伴侶，Hsp60被進(jìn)一步分類為兩個(gè)亞家族，第一類分子伴侶存在于細(xì)菌、線粒體和葉綠體中，例如GroE和chCpn60，第二類伴侶蛋白CCT發(fā)現(xiàn)于古細(xì)菌和真核生物的細(xì)胞質(zhì)溶膠中。研究表明，Hsp60需要ATP水解釋放能量，參與新生肽的合成及折疊，通過(guò)協(xié)助新合成和新轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)其天然構(gòu)象，在蛋白質(zhì)的合成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[22-25]。

水稻（Oryza sativa）在氧脅迫的條件下，Hsp60過(guò)量表達(dá)，避免Fe/S酶釋放Fe2+，保護(hù)其不被氧化，在植物抵抗氧脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要作用[26]。葉綠體Cpn60a基因的突變體擬南芥，在胚和幼苗的發(fā)育以及葉綠體發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷[27]。在轉(zhuǎn)反義Cpn60b基因的煙草中，植株表型出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、葉片失綠、開(kāi)花遲緩等明顯變化。在大腸桿菌中表達(dá)來(lái)自植物海蓮的CCTα蛋白可增強(qiáng)其對(duì)鹽分和滲透脅迫的耐受性[26]。但目前對(duì)Hsp60家族生物功能的探索還有待進(jìn)一步發(fā)掘。

2.2 Hsp70家族

Hsp70家族被認(rèn)為是最高度保守的Hsps。Hsp70家族在動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)變性蛋白、調(diào)控細(xì)胞凋亡和免疫防護(hù)等反應(yīng)機(jī)制方面已有相關(guān)報(bào)道[28]；在高等植物中已經(jīng)鑒定出繁多的Hsp70蛋白，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中，在菠菜基因組中發(fā)現(xiàn)至少有12個(gè)Hsp70蛋白成員基因，擬南芥基因組包含至少18個(gè)編碼Hsp70家族成員的基因[29]。Hsp70家族中的一些成員是組成型表達(dá)的，這些成員參與輔助多肽的折疊和前體蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)，引導(dǎo)溶酶體或蛋白酶來(lái)促進(jìn)不穩(wěn)定蛋白的降解。

Hsp70家族中單個(gè)蛋白的特定功能可能取決于它們?cè)趤喖?xì)胞區(qū)室的不同位置，如細(xì)胞質(zhì)中的Hsp70有阻止蛋白聚集，幫助蛋白折疊，維持細(xì)胞器前體蛋白結(jié)構(gòu)的作用，而線粒體和葉綠體Hsp70蛋白參與前體蛋白的輸入和易位[25]。分析發(fā)現(xiàn)Hsp70基因的過(guò)表達(dá)與植物有較強(qiáng)的耐熱性呈正相關(guān)，并能提高植物對(duì)鹽、水和高溫脅迫的耐受性[30-31]。已有研究表明耐熱品種的甜椒（Triticum aestivum）中CaHsp70的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，同時(shí)可提高甜椒植株的耐熱性[32]。研究還發(fā)現(xiàn)除高溫外ABA激素也會(huì)誘導(dǎo)黃瓜幼苗Hsp70基因的表達(dá)，從而提高其耐熱性，其原理是減少植株體內(nèi)H2O2的積累[33]。

植物Hsp70 BiP蛋白在未折疊蛋白細(xì)胞反應(yīng)機(jī)制（UPR）中可起到保持積累的蛋白質(zhì)未折疊，從而避免在脅迫條件下的蛋白質(zhì)聚集，這一結(jié)果通過(guò)在煙草中過(guò)表達(dá)Hsp70 BiP基因得到證實(shí)[6]。另外Hsp70也可能充當(dāng)熱激因子（HSF）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，Hsp70與HSF之間的相互作用，負(fù)調(diào)控HSF介導(dǎo)的熱激反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄激活，Hsp70蛋白還可能通過(guò)參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中許多下游基因的表達(dá)而發(fā)揮廣泛的作用[34]。

2.3 Hsp90家族

Hsp90是需要ATP參與才能發(fā)揮生物學(xué)功能的主要分子伴侶之一，占細(xì)胞總蛋白的1%～2%[35]。在植物中，已經(jīng)在胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)體定位Hsp90基因，這些基因與酵母和動(dòng)物來(lái)源的Hsp90具有63%～71%的氨基酸同源性[36]。Hsp90的特別之處在于與之相互作用的大多數(shù)底物是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，如類固醇激素受體和信號(hào)激酶[37]。最近的報(bào)告顯示，Hsp90蛋白可與其他蛋白合作，包括Hip（Hsp70相互作用蛋白）、Hop（Hsp70/Hsp90組織蛋白）、p23、Hsp40（DnaJ同源物）、免疫親合劑FKBP51/54和FKBP52以及 Cdc37/p50[38]。

盡管Hsp90蛋白在多數(shù)生物中是組成型表達(dá)的，但它們?cè)谠松锖驼婧松镏械谋磉_(dá)都隨著脅迫而增加，轉(zhuǎn)水稻熱激蛋白Hsp90基因的大豆品種中，可以有效提高其耐干旱能力[12]；有研究顯示，Hsp90還具有緩沖作用，在正常的生理?xiàng)l件下，遺傳變異的表達(dá)被Hsp90緩沖效應(yīng)所隱藏或沉默，當(dāng)生物遇到脅迫環(huán)境時(shí)，Hsp90緩沖系統(tǒng)會(huì)暴露出存在的隱藏突變[39-40]。這種形態(tài)進(jìn)化的“緩沖”作用在擬南芥中被進(jìn)一步證實(shí)，用凝膠霉素處理降低Hsp90的功能，使擬南芥產(chǎn)生了一系列形態(tài)表型，這可能是由于Hsp90在擬南芥中起到遺傳緩沖作用，釋放了正常情況下的遺傳變異，有助于該植物的進(jìn)化適應(yīng)[41]。

2.4 Hsp100家族

Hsp100家族是大型AAA ATPase超家族的成員，具有廣泛的功能特性，但與其他Hsps的生物學(xué)功能有所不同，其不具有防止蛋白質(zhì)聚集和錯(cuò)誤折疊的常規(guī)伴侶功能[42]。Hsp100溶解聚集的蛋白質(zhì)，并在Hsp70系統(tǒng)的輔助下釋放，清除因錯(cuò)誤折疊、變性或聚集引起的有害多肽，在蛋白質(zhì)分解和維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[43]。Hsp100執(zhí)行雙重伴侶和調(diào)節(jié)活性，從而影響蛋白底物的最終命運(yùn)，所作用的蛋白底物要么完全降解，要么展開(kāi)并釋放[44]。

Hsp100家族在擬南芥、蠶豆（Vicia faba）、煙草（Nicotiana）、水稻、玉米（Zea mays）、利 馬 豆（Phaseolus lunatus） 和 小 麥（Triticum aestivum）等植物中均有報(bào)道。與許多其他熱激蛋白一樣，Hsp100家族通常以組成型在植物中表達(dá)，受到如熱、冷、脫水、高鹽或暗誘導(dǎo)等不同的環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)小麥幼苗、玉米等在高溫脅迫下都能誘導(dǎo)合成 Hsp104，酵母中表達(dá)大豆GmHsp104基因，可以使酵母提高耐熱能力。從蠶豆中克隆其葉綠體Hsp100基因，證實(shí)了葉綠體Hsp100基因的表達(dá)與蠶豆的熱應(yīng)激有關(guān)[45]。甘蔗Hsp100蛋白的產(chǎn)生賦予酵母有較強(qiáng)的耐熱性，暗示Hsp100在恢復(fù)細(xì)胞應(yīng)力中發(fā)揮一定作用[46]。

2.5 sHsps家族

sHsps是一類低分子量的熱激蛋白（12～40 kDa）。植物中，sHsps在序列相似性、細(xì)胞定位和生物學(xué)功能方面比其他Hsps家族更加多樣化。原核和真核細(xì)胞中，sHsps在熱和其他脅迫下普遍合成，某些sHsps也在特殊發(fā)育階段表達(dá)[47]。sHsps本身不能重新折疊非天然蛋白質(zhì)，但在結(jié)合非天然蛋白質(zhì)方面具有顯著的效果，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，使其接近其他依靠ATP的成員如Hsp70，從而協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊和構(gòu)型，以便進(jìn)一步加工[14]。sHsps可能通過(guò)疏水相互作用，穩(wěn)定并防止蛋白質(zhì)非天然聚集，從而促進(jìn)它們通過(guò)ATP依賴性伴侶蛋白（如DnaK或ClpB）的重折疊[48-49]。植物sHsps可以應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力，包括熱、冷、干旱、鹽度和氧化脅迫，sHsps還與類囊體膜相互作用，參與植物抗逆[44]。在石竹中已有葉綠體sHsps重要性的相關(guān)報(bào)道。而研究發(fā)現(xiàn)玉米線粒體sHsps（msHsp）在鹽脅迫期間顯示出保護(hù)NADH，改善線粒體電子傳遞的作用[51-52]。過(guò)表達(dá)sHsps基因可以減輕番茄對(duì)鹽脅迫的耐受性，桑樹(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)sHsps的積累可以增強(qiáng)其對(duì)寒冷脅迫的耐受性等越來(lái)越多的研究表明，sHsps的積累與植物對(duì)壓力耐受性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性[53-54]。

3 Hsps與其他應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的相互作用

非生物脅迫會(huì)引起多種反應(yīng)，植物所獲得的耐受性通常是多種脅迫應(yīng)答機(jī)制協(xié)調(diào)作用，重建細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，防止細(xì)胞損傷的結(jié)果[55-56]。脅迫條件下Hsps的保護(hù)作用可歸因于眾多伴侶的協(xié)同作用，發(fā)揮分子伴侶網(wǎng)絡(luò)機(jī)制[57-58]。

3.1 Hsps與滲透物分子相互作用

Hsps與滲透物分子機(jī)制互作是典型的例子，滲透物（如甘氨酸，甜菜堿，甘油，脯氨酸和海藻糖）是一類小分子量的有機(jī)化合物，在生物體中積累以響應(yīng)滲透脅迫，細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)不同滲透物的細(xì)胞內(nèi)水平來(lái)特異性地控制蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，影響蛋白質(zhì)解聚和重折疊[36]。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的滲透物具有增加天然蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和協(xié)助未折疊多肽的重折疊來(lái)充當(dāng)“化學(xué)伴侶蛋白”。對(duì)酵母的研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖與Hsps相互作用，可抑制變性蛋白質(zhì)的聚集，使它們保持部分折疊狀態(tài)，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)功能。發(fā)現(xiàn)鹵蟲(chóng)（Artemia franciscana）在熱脅迫過(guò)程中和熱脅迫后，海藻糖和sHsp（p26）在體外可以協(xié)同作用[59]。這些研究為Hsps伴侶蛋白與其他壓力保護(hù)機(jī)制之間的相互作用提供了新見(jiàn)解。

3.2 Hsps與伴侶蛋白相互作用及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能

除了滲透物外，還發(fā)現(xiàn)Hsp90、Hsp70家族的分子伴侶及其他伴侶蛋白與越來(lái)越多的信號(hào)分子之間有相互作用，包括核激素受體，酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸激酶，以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑，證明它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[38]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中sHsps不僅涉及對(duì)外界刺激的保護(hù)，而且還涉及其他細(xì)胞功能（例如細(xì)胞凋亡和分化）的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)[60]。雖然這些研究大多數(shù)是在植物以外的生物體內(nèi)進(jìn)行的，但類似的交叉互作機(jī)制可能在植物中同樣發(fā)揮作用。例如在擬南芥抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子的依賴性表達(dá)中，HSF不僅參與Hsps合成，還可參與抗氧化基因表達(dá)的相關(guān)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)[61]。然而，Hsps作為細(xì)胞氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)劑,參與植物其他應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制仍有待確定。

4 問(wèn)題與展望

每一類Hsps家族成員不但具有特定的功能，而且相互之間有著密切合作，構(gòu)成不同的Hsps伴侶網(wǎng)絡(luò)。但在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中，特定的Hsps如何識(shí)別其特定的底物（新生肽或喪失功能的蛋白），以及怎樣決定每一種故障蛋白質(zhì)的處理方式，是對(duì)其保持穩(wěn)定還是防止聚集，是將其復(fù)性還是最終聚集并降解，是否存在Hsps伴侶網(wǎng)絡(luò)的中心決定因素，作為調(diào)控因子，Hsps是如何參與應(yīng)激感應(yīng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激基因的轉(zhuǎn)錄激活，這些問(wèn)題尚不清楚。

目前植物和其他生物的大部分研究致力于檢測(cè)Hsps的低表達(dá)或過(guò)表達(dá)在應(yīng)激期間或之后的變化。此外在許多情況下，關(guān)于Hsps在應(yīng)激下的功能的結(jié)論是基于體外測(cè)定分析的結(jié)果，這主要是因?yàn)槿狈线m的突變體，有些特定的Hsps不發(fā)生表達(dá)。未來(lái)的研究應(yīng)致力于創(chuàng)造缺乏特異性或幾種Hsps的植物突變體，并應(yīng)用現(xiàn)有突變體的結(jié)果與之關(guān)聯(lián)分析。同時(shí)在研究植物中一種或多種應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制變化中，還應(yīng)該對(duì)Hsps蛋白的變化、結(jié)構(gòu)變化要著重分析。在今后的研究中，期望能對(duì)Hsps和其他植物中應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制之間互作關(guān)系的深入研究，進(jìn)而為植物獲得性應(yīng)激耐受性的研究提供理論依據(jù)。