傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌群落演替及對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響分析

李春生，王悅齊，李來好*，陳勝軍，吳燕燕，胡 曉，榮 輝

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300）

魚露也稱“魚醬油”，是一種以低值魚類或水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為原料，經(jīng)過天然發(fā)酵制得的風(fēng)味獨(dú)特的調(diào)味品。魚露色澤呈琥珀色，味道鮮美，富含?；撬帷⑷梭w必需氨基酸、有機(jī)酸、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，備受人們的青睞。傳統(tǒng)魚露作為一種天然發(fā)酵產(chǎn)品，發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)10—18 個(gè)月，其發(fā)酵過程是以蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為基質(zhì)，在微生物和酶的作用下發(fā)生以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為主體的一系列復(fù)雜代謝活動(dòng)，逐漸產(chǎn)生醛、酮、醇、酯等化合物[1-2]，從而形成魚露獨(dú)特的風(fēng)味。

微生物是傳統(tǒng)魚露風(fēng)味形成不可或缺的因素，明確傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于揭示魚露風(fēng)味形成機(jī)制具有重要作用，是實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)魚露產(chǎn)業(yè)技術(shù)提升的重要環(huán)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要利用純培養(yǎng)方式對(duì)魚露中的微生物進(jìn)行探索，在具有特定活性微生物篩選方面已取得了大量成果，如從魚露發(fā)酵液中分離高產(chǎn)蛋白酶活性的Virgibacillus sp. SK33[3]、Bacillus subtilis CN2[4]、Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7[5]等，分離具有高效生物胺降解活性的Halomonas shantousis SWA25[6]、Staphylococcus carnosus FS19[7]等。然而，自然界中微生物群落及其棲息的環(huán)境遠(yuǎn)比人們預(yù)期的復(fù)雜和多樣，通過純培養(yǎng)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室所獲取的微生物僅占環(huán)境微生物總量的1%左右，這使得傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法在魚露微生物研究上存在局限性，無法全面揭示魚露中微生物的真實(shí)狀況。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于高通量測(cè)序技術(shù)的非培養(yǎng)方法為全面真實(shí)地了解環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)提供了可能，此方法直接從環(huán)境中提取微生物群體基因組DNA，通過對(duì)微生物rRNA基因的若干可變區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定，可全面真實(shí)地反映環(huán)境樣品中微生物的種類和豐度。近年來，高通量測(cè)序技術(shù)已在豆醬[8]、蝦醬[9]、糯米酒[10]、干酪[11]等多種發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)研究上進(jìn)行了應(yīng)用。然而，目前關(guān)于我國(guó)傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究鮮見報(bào)道。

鑒于此，本研究采用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間下魚露細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行高通量測(cè)序，分析魚露發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化規(guī)律，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)研究魚露發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，并利用Pearson相關(guān)性分析方法研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)傳統(tǒng)魚露揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響規(guī)律，這對(duì)于揭示魚露風(fēng)味的形成機(jī)制以及優(yōu)化傳統(tǒng)魚露的發(fā)酵工藝具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚露采自于廣東省魚露生產(chǎn)廠家，根據(jù)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，按照30%的用鹽量將鳀魚和食鹽進(jìn)行混合，在的發(fā)酵池中進(jìn)行發(fā)酵，取發(fā)酵時(shí)間為0、1、3、6、12 個(gè)月的魚露發(fā)酵液，用定性濾紙過濾，收集濾液保存于－80 ℃冰箱待測(cè)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega科技公司；AMPure XP beads核酸純化試劑盒 美國(guó)Beckman公司；2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）標(biāo)準(zhǔn)品 日本TCI公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；GCMSQP2010 plus GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；65 μm DVB-PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 魚露發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

參照文獻(xiàn)[12]方法。采用美國(guó)Omega科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）提取魚露發(fā)酵液中細(xì)菌的基因組DNA。設(shè)計(jì)細(xì)菌的16S rRNA基因序列V4片段擴(kuò)增的通用引物：515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。使用AMPure XP beads核酸純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，利用Illumina MiSeq PE250進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3.2 靜態(tài)頂空固相微萃取揮發(fā)性物質(zhì)

參照文獻(xiàn)[13]方法。將5.0 g過濾后的魚露樣品置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入2 μL內(nèi)標(biāo)物TMP溶液（1 000 mg/L），封閉瓶口后插入已老化好的萃取頭，置于溫度為60 ℃的磁力攪拌臺(tái)上，吸附40 min，再插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸5 min，重復(fù)測(cè)定3 次。為防止樣品間交叉污染，連續(xù)進(jìn)樣的萃取頭需要在270 ℃的條件下老化10 min。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS檢測(cè)條件

色譜柱為CD-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min，采用恒線速率，分流比1∶20，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序：起始溫度35 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫到60 ℃保持1 min，再以6 ℃/min上升到140 ℃保持1 min，最后以8 ℃/min升溫到230 ℃，保持5 min。離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～350，無溶劑切除時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 Illumina MiSeq PE250測(cè)序結(jié)果分析

原始的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾處理獲得Clean Data，然后利用FLASH（v1.2.11）軟件將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads進(jìn)行組裝，得到高變區(qū)的Tags。利用USEARCH（v7.0.1090）軟件將組裝好的Tags在97%相似度條件下進(jìn)行聚類，得到用于物種分類的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）序列。利用RDP classifer（v2.2）軟件將OTU序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得物種注釋。根據(jù)每個(gè)物種在每個(gè)樣品的相對(duì)豐度進(jìn)行物種熱圖分析。利用mothur（v1.31.2）軟件計(jì)算樣品的α多樣性值，包括observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)。利用QIIME（v1.80）軟件計(jì)算不同樣品間的β多樣性值，包括Bray-Curtis、weighted UniFrac、unweighted UniFrac等。

1.4.2 揮發(fā)性風(fēng)味化合物定量分析

利用Xcalibur軟件對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行鑒定。利用計(jì)算機(jī)檢索各化合物，與WILEY和NIST 05a. L譜庫數(shù)據(jù)庫相匹配，僅報(bào)道正反匹配度均大于800的結(jié)果。

各揮發(fā)性風(fēng)味化合物的絕對(duì)含量按照待測(cè)揮發(fā)物與內(nèi)標(biāo)物TMP的峰面積之比求得其絕對(duì)含量，計(jì)算公式如下：

式中：P為正己醛與內(nèi)標(biāo)物TMP的峰面積之比；N為內(nèi)標(biāo)物TMP的質(zhì)量/μg；M為稱取的魚露樣品質(zhì)量/g。

1.4.3 相關(guān)性分析

利用SPSS 19.0分析軟件中的z-score標(biāo)準(zhǔn)化法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行線性變換，將結(jié)果映射在一定的區(qū)間范圍，導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)化后的變量，然后利用Pearson相關(guān)性分析對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后變量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Illumina MiSeq PE250測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)研究不同發(fā)酵時(shí)間下傳統(tǒng)魚露細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化，測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表1所示。所有樣品一共得到156 304 條Tags，平均每個(gè)樣品有31 260 條，Tags的平均長(zhǎng)度為（252±1）bp。Tags經(jīng)過優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU。5 個(gè)樣品共產(chǎn)生387 種OTU，其中6 個(gè)月的OTU種類最多，達(dá)到312 種。

表1 魚露發(fā)酵過程細(xì)菌16S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 16S rRNA sequencing data statistics of bacteria in fish sauce during fermentation

2.2 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性變化

2.2.1 α多樣性分析

α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性進(jìn)行分析，observed species指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則同時(shí)考慮群落中物種豐富度和物種均勻度的影響[14]。不同發(fā)酵階段魚露細(xì)菌α多樣性分析如表2所示。結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，魚露中細(xì)菌多樣性越顯豐富；發(fā)酵時(shí)間為6、12 個(gè)月時(shí)，魚露中細(xì)菌多樣性最為豐富；發(fā)酵時(shí)間為6 個(gè)月時(shí)魚露細(xì)菌群落中物種的數(shù)量最多，而發(fā)酵12 個(gè)月時(shí)細(xì)菌群落中物種更為均勻。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間魚露細(xì)菌α多樣性分析Table 2 α Diversity analysis for bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages

2.2.2 Venn圖分析

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間魚露細(xì)菌群落Venn圖分析Fig. 1 Venn diagram analysis of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages

利用Venn圖可以展示多個(gè)樣品共有和各自特有OTU數(shù)目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。如圖1所示，5 個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)共有的細(xì)菌種類為62 種；發(fā)酵后期即6、12 個(gè)月份共有的細(xì)菌種類最多，達(dá)到237 種；發(fā)酵時(shí)間為6 個(gè)月時(shí)，獨(dú)有的細(xì)菌種類最多，達(dá)到42 種。

2.2.3 β多樣性分析

采用Bray-Curtis、unweighted UniFrac、weighted UniFrac等β多樣性指標(biāo)比較不同發(fā)酵時(shí)間魚露細(xì)菌多樣性差異，如圖2所示。Bray-Curtis的計(jì)算只考慮樣品中物種的存在情況，而不考慮序列間的進(jìn)化距離。結(jié)果顯示，發(fā)酵前期0、1、3 個(gè)月之間菌群差異較小，而與發(fā)酵后期6、12 個(gè)月的菌群差異較大（圖2A）。UniFrac是通過利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來比較不同樣品間物種群落差異，其中unweighted UniFrac不考慮物種豐度，weighted UniFrac考慮物種豐度。結(jié)果顯示，在不考慮物種豐度的情況下，0 個(gè)月和1 個(gè)月之間菌群差異較小，6 個(gè)月和12 個(gè)月之間菌群差異較小，3 個(gè)月與6、12 個(gè)月之間的群落結(jié)構(gòu)更為相似（圖2B）。在考慮物種豐度的情況下，結(jié)果與Bray-Curtis分析結(jié)果相似，發(fā)酵前期0、1、3 個(gè)月之間菌群差異較小，發(fā)酵后期6、12 個(gè)月之間菌群差異較小，但是發(fā)酵前期與發(fā)酵后期菌群差異較大（圖2C）。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間魚露細(xì)菌β多樣性熱圖分析Fig. 2 β Diversity heat map analysis of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages

2.3 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 基于門水平傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖3 在門水平下魚露不同發(fā)酵時(shí)期菌群相對(duì)豐度柱形圖（A）和熱圖（B）分析Fig. 3 Stacked-column (A) and heat map (B) analysis of relative abundances of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages at the phylum level

如圖3所示，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是魚露整個(gè)發(fā)酵過程中最主要的菌群，此結(jié)果與蝦醬[15]和豆瓣醬[8]中報(bào)道的結(jié)果相似。在起始發(fā)酵階段，主要以Firmicutes為主，并在3 個(gè)月時(shí)Firmicutes的相對(duì)豐度達(dá)到最高（96.8%）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)irmicutes的豐度逐漸降低，而Proteobacteria的豐度逐漸升高，在12 個(gè)月時(shí)達(dá)到46.0%。這個(gè)結(jié)果與蝦醬中菌群變化結(jié)果有所不同：發(fā)酵初期主要為Proteobacteria，發(fā)酵后期Firmicutes代替Proteobacteria成為主要菌群[15]。

2.3.2 基于屬水平傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)變化

圖4 在屬水平下魚露不同發(fā)酵時(shí)期菌群相對(duì)豐度柱形圖（A）和熱圖（B）分析Fig. 4 Stacked-column (A) and heat map (B) analysis of relative abundances of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages at the genus level

如圖4所示，不同發(fā)酵時(shí)期在屬的水平下魚露的菌群顯著不同，其中鹽厭氧菌屬（Haloanaerobium）是魚露整個(gè)發(fā)酵過程中最主要的菌群。這個(gè)結(jié)果與蝦醬[15]、罐裝腌漬鯡魚（Surstr?mming）[16]和韓國(guó)魚醬油（Myeolchi-Aekjeot）[17]中菌群變化結(jié)果一致。在發(fā)酵起始階段，Haloanaerobium的相對(duì)豐度逐漸升高，并在3 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高（92.1%），隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，Haloanaerobium的相對(duì)豐度逐漸降低。與發(fā)酵初期相比，發(fā)酵中后期時(shí)鹽單胞菌屬（Halomonas）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）等菌群的相對(duì)豐度增加最為顯著。發(fā)酵末期，Halomonas成為優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度為25.8%。Tetragenococcus是豆瓣醬、泰國(guó)魚醬油[8,18-19]等鹽漬發(fā)酵食品中主要的菌群。本研究中，Tetragenococcus雖然是魚露發(fā)酵過程中主要的菌群之一，但是與報(bào)道的鹽漬發(fā)酵食品相比，Tetragenococcus的豐度相對(duì)較低。

2.4 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量變化

傳統(tǒng)魚露不同發(fā)酵時(shí)期揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量變化結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵1、3、6、12 個(gè)月的魚露樣品共檢測(cè)出54 種揮發(fā)性化合物，包括醛類（13 種）、酮類（5 種）、醇類（7 種）、酯類（5 種）、烴類（8 種）、酸類（7 種）和含氮化合物（9 種）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醛類、醇類、酸類、酯類和烴類化合物的總含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，酮類化合物的總含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，含氮化合物的總含量則變化不大。在整個(gè)魚露發(fā)酵過程，醛類、醇類、酸類化合物的總含量明顯高于其他風(fēng)味化合物。

醛類化合物是脂質(zhì)氧化的降解產(chǎn)物，一般具有令人愉快的氣味，如青草味、麥芽香味、水果香味和奶酪味[20-21]。在本研究中，醛類化合物是魚露發(fā)酵過程中種類最多和含量最高的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。3-甲硫基丙醛、2-甲基丙醛和3-甲基丁醛是含量最高的醛類化合物，其含量變化與醛類化合物總含量變化相似，在12 個(gè)月時(shí)含量達(dá)到最高。庚醛是魚腥味的主體成分，12 個(gè)月時(shí)魚露中庚醛的含量比1 個(gè)月降低了67.5%。其他9 種醛類化合物的含量較低，其中（E,Z）-2,6-壬二烯醛的含量最低，在整個(gè)發(fā)酵過程中均低于1 μg/kg。酮類化合物一般會(huì)產(chǎn)生醚味、奶酪味、焦香味[13,22]。魚露發(fā)酵過程共發(fā)現(xiàn)5種酮類化合物，相比于其他種類的風(fēng)味化合物，酮類化合物的含量較低。

圖5 傳統(tǒng)魚露不同發(fā)酵時(shí)間揮發(fā)性化合物含量變化Fig. 5 Changes in contents of volatile flavor components in fish sauce at different fermentation stages

如圖5所示，醇類化合物主要來源于碳水化合物、氨基酸和脂肪的代謝[23-24]。魚露發(fā)酵過程中，乙醇、2-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇的含量相對(duì)較高，在4 個(gè)發(fā)酵階段均被檢出。魚露發(fā)酵過程中酯類化合物主要來源于醇類和酸類物質(zhì)的酯化反應(yīng)，其中以乙酯類物質(zhì)為主，這可能與魚露發(fā)酵過程產(chǎn)生高濃度的乙醇有關(guān)，其中乙酸乙酯的含量最高，在4 個(gè)發(fā)酵階段均被檢出。這個(gè)結(jié)果與醬油中酯類揮發(fā)性化合物的報(bào)道一致[25-26]。

烴類化合物是魚露發(fā)酵過程中含量最低的一類揮發(fā)性化合物，共檢測(cè)到8 種烴類化合物，但是這幾種化合物的含量都較小，而且烷烴類化合物通常認(rèn)為不具有氣味活性[27]，因此烴類化合物對(duì)魚露整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小。魚露發(fā)酵過程共檢測(cè)到7 種酸類化合物，其中只有乙酸在4 個(gè)發(fā)酵階段均被檢出，其含量變化與乙酸乙酯含量變化一致。

含氮化合物來源于碳水化合物和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)或者氨基酸的熱分解。三甲胺、2-異戊基-6-甲基吡嗪和2-乙基呋喃在4個(gè)發(fā)酵階段均被檢出。三甲胺是魚露中魚腥味的主體成分，與庚醛的變化相似，發(fā)酵12 個(gè)月后魚露中三甲胺含量比發(fā)酵1 個(gè)月降低了63.4%，結(jié)果表明發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有利于降低魚露的腥味。

氣味活性值（odor activity value，OAV）是香氣化合物濃度與其閾值的比值，已廣泛應(yīng)用于特征性香氣活性化合物的篩選，OAV≥1，則可認(rèn)為此揮發(fā)性物質(zhì)為主體呈香風(fēng)味化合物，且OAV越大對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)程度越高[28]。本研究利用OAV從魚露發(fā)酵過程檢測(cè)到的54 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物中篩選主體呈香化合物，結(jié)果如表3所示。在魚露整個(gè)發(fā)酵過程中共有9 種化合物為主體呈香風(fēng)味化合物（OAV≥1），其中3-甲硫基丙醛（土豆香味）的平均OAV最大，達(dá)到135.98，其次是3-甲基丁醛（麥芽香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、2-甲基丙醛（麥芽香味）和乙酸乙酯（水果香味），另外還有2-乙基呋喃（青草味）、三甲胺（魚腥味）、2-甲基-1-丁醇（麥芽香味）和己醛（青草味、脂味），這些風(fēng)味化合物對(duì)魚露的整體香氣輪廓有顯著的貢獻(xiàn)。本研究結(jié)果與Fukami等[29]對(duì)魚露的特征揮發(fā)性風(fēng)味化合物鑒定結(jié)果相似。這些呈香風(fēng)味化合物也被證實(shí)為是醬油[30]和豆瓣醬[31]等發(fā)酵食品的關(guān)鍵香氣化合物。結(jié)果表明，這9 種風(fēng)味化合物可能是傳統(tǒng)魚露的關(guān)鍵主體呈香風(fēng)味化合物。

表3 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中的主體呈香化合物（OAV≥1）Table 3 Principal aroma compounds (OAV ≥ 1) in fish sauce at different fermentation stages

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)傳統(tǒng)魚露揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響規(guī)律

本研究篩選Halanaerobium、Halomonas、Photobacterium和Tetragenococcus 4 種優(yōu)勢(shì)菌群與3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-乙基呋喃、三甲胺、2-甲基-1-丁醇、己醛9 種主體風(fēng)味化合物，利用Pearson相關(guān)性分析研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)傳統(tǒng)魚露揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響規(guī)律，如表4所示。Halanaerobium與三甲胺呈顯著正相關(guān)，與乙酸乙酯呈顯著負(fù)相關(guān)，結(jié)果預(yù)示Halanaerobium可能會(huì)抑制傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中水果香味的產(chǎn)生，促進(jìn)傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中魚腥味的生成。Halomonas與2-甲基丙醛呈顯著正相關(guān)，結(jié)果預(yù)示Halomonas可能會(huì)促進(jìn)傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中麥芽香味的生成。Photobacterium和Tetragenococcus與9 種主體風(fēng)味化合物均無顯著相關(guān)。有趣的是Halomonas與除三甲胺以外的8 種主體呈香化合物均呈正相關(guān)，而這8 種化合物的含量均在發(fā)酵12 個(gè)月時(shí)達(dá)到最大，結(jié)果預(yù)示Halomonas可能在魚露發(fā)酵后期揮發(fā)性風(fēng)味形成上發(fā)揮著重要作用。

表4 優(yōu)勢(shì)菌群與主體揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間的Pearson相關(guān)性分析Table 4 Pearson’s correlation analysis between dominant bacterial communities and principal aroma compounds

3 結(jié) 論

采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究魚露發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化，魚露發(fā)酵過程細(xì)菌多樣性較為豐富，共檢測(cè)到387 種細(xì)菌。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，魚露細(xì)菌種類先上升后下降，在6 個(gè)月達(dá)到最大（312 種），從6 個(gè)月增加到12 個(gè)月菌群多樣性有所下降但菌群差異性變小。Firmicutes和Proteobacteria是魚露整個(gè)發(fā)酵過程中最主要的門。Haloanaerobium是魚露發(fā)酵過程中最主要的屬，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其相對(duì)豐度先上升后下降，在3 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高（92.1%）。與發(fā)酵初期（0 個(gè)月）相比，發(fā)酵中后期Photobacterium、Tetragenococcus和Halomonas等菌群的相對(duì)豐度增加最為顯著。發(fā)酵末期（12 個(gè)月），Halomonas成為優(yōu)勢(shì)的菌群，其相對(duì)豐度為25.8%。采用GC-MS技術(shù)研究魚露發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，共檢測(cè)出醛、醇、酮、酯、烴、酸、含氮化合物7大類共54 種揮發(fā)性化合物，并根據(jù)OAV≥1篩選到9 種主體呈香風(fēng)味化合物，其中3-甲硫基丙醛（土豆香味）的平均OAV最大（135.98），其次是3-甲基丁醛（麥芽香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、2-甲基丙醛（麥芽香味）、乙酸乙酯（水果香味）、2-乙基呋喃（青草味）、三甲胺（魚腥味）、2-甲基-1-丁醇（麥芽香味）和己醛（青草味、脂味），這些風(fēng)味化合物對(duì)魚露的整體香氣輪廓有顯著貢獻(xiàn)。利用Pearson相關(guān)性分析考察4 種主要優(yōu)勢(shì)菌群與9 種主體風(fēng)味化合物之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Halanaerobium與三甲胺呈顯著正相關(guān)，與乙酸乙酯呈顯著負(fù)相關(guān)，Halanaerobium可能會(huì)抑制傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中水果香味的產(chǎn)生，促進(jìn)傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中魚腥味的生成；Halomonas與2-甲基丙醛呈顯著正相關(guān)，Halomonas可能會(huì)促進(jìn)傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中麥芽香味的生成。