一種米曲霉耐鹽蛋白酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

毛丙永，劉艷鳳，趙國(guó)忠，崔樹(shù)茂，趙建新,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

米曲霉是目前醬油釀造中最重要的菌株，由于其不產(chǎn)毒素，且胞外蛋白酶系十分復(fù)雜[1]，是分解大豆蛋白的最佳選擇[2]，能夠賦予醬油獨(dú)特的風(fēng)味[3]。米曲霉的胞外蛋白酶系通過(guò)頂端分泌的方式分泌至胞外[4-5]，其基因組中有135 個(gè)胞外蛋白酶基因[6]，在醬油發(fā)酵期間，蛋白酶之間交替發(fā)生作用。米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶如此重要，引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。Su Guowan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉蛋白酶粗提物水解脫脂大豆的能力優(yōu)于堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶等商業(yè)蛋白酶。微生物生產(chǎn)得到的工業(yè)蛋白酶，約75%被用于烘焙、釀造、發(fā)酵、明膠、肉類、皮革和洗滌劑等領(lǐng)域[8]。在醬油發(fā)酵后期，NaCl質(zhì)量濃度高達(dá)12～18 g/100 mL，許多蛋白酶的活性被抑制，只有一些耐鹽的蛋白酶仍保持較高的酶活力，導(dǎo)致原料水解不徹底，發(fā)酵周期被延長(zhǎng)。因此，從米曲霉中純化得到耐鹽蛋白酶，對(duì)于指導(dǎo)醬油發(fā)酵具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)旨在從米曲霉3.042中，挖掘一種具有潛在工業(yè)價(jià)值的耐鹽蛋白酶，從而指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉3.042保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心；Q-HP陰離子柱、Superdux 75凝膠柱 通用電氣醫(yī)療集團(tuán)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天有限公司；福林-酚、40%聚丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（29∶1）、胰蛋白酶（均為分析純） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA avant全自動(dòng)蛋白快速分離系統(tǒng) 瑞典GE公司；ultrafleXtreme基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 美國(guó)布魯克·道爾頓公司；MOS-450圓二色譜儀 法國(guó)Biologic公司；UV2450型分光光度計(jì)日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 種曲培養(yǎng)條件

稱取100 g麥麩，添加110 mL蒸餾水，按照30 g/500 mL三角瓶分裝，121 ℃滅菌20 min。待溫度冷卻至40 ℃以下，接入米曲霉，搖勻，30 ℃堆積培養(yǎng)，待瓶?jī)?nèi)泛白后搖瓶培養(yǎng)，生長(zhǎng)至黃綠色時(shí)，將種曲裝入牛皮紙袋中，密封，50 ℃烘干，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大曲培養(yǎng)條件

稱取60 g豆粕，添加110 g沸水浸泡30 min后，加入40 g麩皮，攪拌均勻，121 ℃滅菌20 min，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5‰接種種曲，28 ℃、相對(duì)濕度90%培養(yǎng)，控制溫度低于40 ℃，待大曲變?yōu)辄S色，立即收集并提取蛋白酶。

1.3.3 粗酶液提取

稱取一定量的大曲，按照料液比為1∶20添加0.9%無(wú)菌生理鹽水，40 ℃水浴1 h，不斷攪拌，紗布過(guò)濾，4 ℃、8 000×g離心20 min，收集上清液。

1.3.4 硫酸銨分級(jí)沉淀

參考Wang Dong等[9]的方法。量取一定體積的粗酶液，低溫?cái)嚢杓尤肓蛩徜@，使之飽和度分別達(dá)到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，每一飽和度在4 ℃靜置4 h，9 000×g離心20 min，20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl重懸沉淀，使用8～14 kDa透析袋透析脫鹽，使用聚乙二醇20000濃縮樣品，凍干冷藏備用。

1.3.5 Q-HP陰離子交換

上樣緩沖液A為20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl，洗脫液B為1 mol/L NaCl，流速為2 mL/min，洗脫條件：100% A，0% B，15 BV；90% A，10% B，15 BV；20% B，15 BV。收集樣品測(cè)定酶活力，做十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.6 Superdux 75凝膠層析

用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl平衡柱子，并洗脫，流速為0.4 mL/min，收集樣品測(cè)定酶活力，做SDS-PAGE。

1.3.7 蛋白酶活力測(cè)定

參考SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》的方法。取待測(cè)樣品1 mL以及質(zhì)量濃度2 g/100 mL酪蛋白溶液，pH 7.2，40 ℃水浴2 min，取出立即加入1 mL酪蛋白，40 ℃水浴反應(yīng)10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液，水浴20 min使蛋白質(zhì)沉淀，隨后使用0.22 μm針頭式濾器過(guò)濾，然后取1 mL濾液，加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液，加入1 mL稀釋3 倍的福林-酚試劑混勻，40 ℃水浴20 min，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定光密度。40 ℃時(shí)每分鐘水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸，被定義為1 個(gè)蛋白酶活力單位（U）。1.3.8 蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.9 蛋白酶SDS-PAGE分析

參考Laemmli[10]的方法。濃縮膠質(zhì)量濃度為5 g/100 mL，分離膠質(zhì)量濃度為12 g/100 mL，利用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.3.10 飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定蛋白酶

參考Vejvoda等[11]的方法。將上述SDS-PAGE的蛋白條帶切下，切成1 mm3的小膠塊，置于1.5 mL EP管中，加入200～400 μL 100 mmol/L NH4HCO3/30% ACN混合溶液脫色，清洗至透明，去除上清液，用50 μL ACN脫水2 次，得到白色膠粒。加入5 μL 2.5～10 ng/μL胰蛋白酶溶液，4 ℃放置30～60 min，使膠塊充分溶脹，吸出剩余酶液。再加入20～30 μL 25 mmol/L NH4HCO3緩沖液，37 ℃水浴20 h。吸出酶解液，冷凍濃縮，點(diǎn)樣，進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢索參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 檢索參數(shù)設(shè)置Table 1 Parameters of database search

1.3.11 蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定得到的蛋白序列，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行比對(duì)，得到蛋白酶的氨基酸序列，將此序列在Swiss model（http://www.swissmodel.expasy.org/）中進(jìn)行模型擬合，按照GMQE值選擇匹配度較高的模型。

1.3.12 蛋白酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性測(cè)定

參考Lee等[12]的方法。pH 7.2時(shí)，在20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃測(cè)定蛋白酶活力，計(jì)算不同溫度條件下的相對(duì)酶活力，酶活力最高的溫度即為最適溫度。

pH 7.2時(shí)，把蛋白酶放置于35、40、45、50 ℃和55 ℃分別保溫20、40、60、80 min和100 min，在40 ℃、pH 6.5條件下測(cè)定其蛋白酶活力，保溫前的酶活力被定義為100%，計(jì)算其他條件下的相對(duì)酶活力，酶活力最高的溫度即為最適溫度。

1.3.13 蛋白酶最適pH值和pH值穩(wěn)定性測(cè)定

參考Lee等[12]的方法。利用pH 4.5、5.0和pH 5.5檸檬酸緩沖液，pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和pH 9.0 Tris-HCl緩沖液配制質(zhì)量濃度2 g/100 mL酪蛋白溶液，并調(diào)節(jié)酶液至相應(yīng)的pH值，在40 ℃測(cè)定不同pH值條件下蛋白酶活力，計(jì)算不同pH值的相對(duì)酶活力，最高酶活力的pH值即為最適pH值。

將調(diào)至pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和pH 9.0的酶液，40 ℃分別保溫30、60、90 min以及120 min，在40 ℃、pH 6.5條件下測(cè)定其蛋白酶活力，保溫前的酶活被定義為100%，最高酶活的pH值即為穩(wěn)定pH值，計(jì)算其他條件下的相對(duì)酶活力。

1.3.14 金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響

配制NaCl、CaCl2、MnSO4、CuCl2、FeSO4、FeCl3和KCl溶液，與蛋白酶混合使金屬離子終濃度達(dá)到2 mmol/L，在40 ℃、pH 7.0條件下測(cè)定酶活力，不添加金屬離子測(cè)得的酶活力定義為100%，計(jì)算不同金屬離子條件下的相對(duì)酶活力。

1.3.15 蛋白酶動(dòng)力學(xué)特征測(cè)定

參考Lineweaver等[13]的方法。配制1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L和13.0 g/L的酪蛋白溶液，在40 ℃、pH 7.0條件下測(cè)定其反應(yīng)速率，然后繪制1/S-1/V的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，根據(jù)曲線的橫截距為－1/Km，縱截距為1/Vm，求出蛋白酶的米氏常數(shù)Km以及最大反應(yīng)速率Vm。

1.3.16 金屬離子影響下蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考Sreerama等[14]的方法。樣品蛋白質(zhì)量濃度范圍0.01～0.2 mg/mL，添加NaCl、CaCl2、MnSO4、CuCl2、FeSO4、FeCl3和KCl溶液，使金屬離子終濃度為2 mmol/L，掃描波長(zhǎng)190～250 nm，掃描速率100 nm/min，光程1 mm，使用SELCON3進(jìn)行分析。

1.3.17 蛋白酶的耐鹽特性

蛋白酶液中加入NaCl溶液，使其終濃度質(zhì)量分別為5、10 g/100 mL和15 g/100 mL，在pH 7.0，40 ℃的條件下測(cè)定酶活力，不添加Na+測(cè)得的酶活力定義為100%，計(jì)算不同濃度Na+條件下的相對(duì)酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以 ±s表示（n=3），圖形采用Origin 8.5軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉蛋白酶的分離純化

圖1 蛋白酶的鹽析曲線Fig. 1 Salting-out profile of protease

酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝151.81x－1.582 4，R2＝0.999 1。蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.507 2x+0.001 4，R2＝0.999 7。由蛋白酶的鹽析曲線（圖1）可以看出，隨著硫酸銨飽和度的增加，析出的蛋白酶活力呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，尤其是當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到70%、80%、90%時(shí)，酶活力分別達(dá)到（1 471.11±1.01）、（1 451.02±0.71）、（1 426.54±0.67） U/mL，但是比酶活并沒(méi)有顯著高于其他飽和度，故選用30%～90%飽和度進(jìn)行分級(jí)沉淀，提高回收率。

圖2 蛋白酶的Q-HP洗脫曲線Fig. 2 Elution profile of protease on Q-HP column

如圖2所示，檢測(cè)各個(gè)峰的酶活力顯示，第2個(gè)峰酶活力最高，達(dá)（151.51±4.41） U/mL，SDS-PAGE結(jié)果顯示有2條明顯條帶，故收集合并第2個(gè)峰的酶液，使用30 kDa超濾離心管濃縮，進(jìn)行下一步純化。

如圖3所示，凝膠層析分離效果較好，收集第1個(gè)峰的樣品檢測(cè)其具有蛋白酶活力，SDS-PAGE呈現(xiàn)單一條帶。Li Caihong等[15]利用硫酸銨分級(jí)沉淀，離子交換柱和凝膠層析聯(lián)合使用，從米曲霉FC76中純化得到一種酸性蛋白酶。Rafael等[16]通過(guò)乙醇沉淀，凝膠層析和離子交換柱聯(lián)合使用，從米曲霉中純化出一種絲氨酸蛋白酶。也由此可以看出，離子交換柱和凝膠層析聯(lián)合使用，是蛋白酶純化過(guò)程中常用的技術(shù)手段。

圖3 蛋白酶的Superdux 75洗脫曲線Fig. 3 Elution profile of protease on Superdux 75 column

如表2所示，隨著純化步驟的增加，蛋白的比酶活和純化倍數(shù)呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，Superdux 75凝膠層析后比酶活達(dá)到1 422.76 U/mg，純化倍數(shù)為94.47，回收率為2.73%。

表2 蛋白酶純化結(jié)果Table 2 Purification of the protease

2.2 蛋白酶SDS-PAGE分析

圖4 蛋白酶的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the protease

由圖4可以看出，純化得到的蛋白酶達(dá)到電泳純，分子質(zhì)量約為93.33 kDa。

2.3 飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定蛋白酶

飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定該蛋白酶可能為鈣蛋白酶RIM13（Gene ID：AO090005000756），是一種半胱氨酸蛋白酶，分子質(zhì)量為88.89 kDa，該蛋白酶于2012年在米曲霉3.042中被鑒定[17]。米曲霉3.042中也曾純化得到中性蛋白酶，分子質(zhì)量分別為50 kDa[18]、27 kDa和58 kDa[19]、37 kDa和45 kDa[20]。鈣蛋白酶RIM13首次從米曲霉3.042中分離得到，安全特性高，可以直接應(yīng)用于醬油工業(yè)發(fā)酵。鈣蛋白酶是一種信號(hào)蛋白酶，在堿性環(huán)境中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子PacC，分泌堿性蛋白和異青霉素N-合成酶等，提高菌體在高pH值環(huán)境中的適應(yīng)性[21]。半胱氨酸的活性中心是Cys-His-Asn三聯(lián)體[22]，應(yīng)用廣泛，也被用于降解乳品工業(yè)廢棄物，如干酪乳清等[23]。

2.4 蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

蛋白酶在Swiss model中匹配到的結(jié)果是鈣蛋白酶[24]，GMQE值為0.33，該蛋白酶包含3 個(gè)肽段，分別為鈣蛋白酶-2催化亞基、鈣蛋白酶小亞基，鈣蛋白酶抑制蛋白，以及10 個(gè)非共價(jià)的Ca2+配體（圖5）。三級(jí)結(jié)構(gòu)的表征更有助于從結(jié)構(gòu)上驗(yàn)證該蛋白酶的性質(zhì)。

圖5 蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 5 Predicted tertiary structure of the protease

2.5 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 蛋白酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

圖6 蛋白酶的溫度-相對(duì)酶活力曲線Fig. 6 Optimum temperature of the protease

如圖6所示，在20～50 ℃，蛋白酶活力呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)酶活力最高，為（90.28±0.76） U/mL。當(dāng)溫度升至50 ℃以上時(shí)，酶活力迅速降低，80 ℃時(shí)酶活力降至（0.61±0.30） U/mL，這也表明此蛋白酶不耐高溫，60 ℃以上酶幾乎失活。如圖7所示，該蛋白酶在35 ℃和40 ℃時(shí)蛋白酶保持較穩(wěn)定，35 ℃和40 ℃保持100 min，酶活力分別保留

圖7 蛋白酶的溫度-相對(duì)酶活力穩(wěn)定性曲線Fig. 7 Effect of temperature on the activity of the protease

77.96 %和85.70%。在45 ℃和50 ℃時(shí)隨著保溫時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白酶活力迅速下降，保溫100 min后，酶活力分別保留41.70%和16.95%，表明該蛋白酶在此溫度下不能穩(wěn)定保存。

2.5.2 蛋白酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

圖8 蛋白酶的pH值相對(duì)酶活力曲線Fig. 8 Optimum pH profile of the protease

如圖8所示，pH 4.5～6.5，酶活力呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，pH 6.5時(shí)酶活力最高，達(dá)到（89.06±1.07）U/mL。當(dāng)pH值繼續(xù)升高時(shí)，酶活力呈下降趨勢(shì)，在pH 9.0時(shí)酶活力下降至（58.70±0.70）U/mL，故此蛋白酶最適pH值為6.5。每一種酶均具有最適pH值，是由于Hofmeister效應(yīng)，在不同pH值的體系中，酶表面的氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的電荷分布受到影響，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合以及催化效率[25]。

圖9 蛋白酶的pH值-相對(duì)酶活力穩(wěn)定性曲線Fig. 9 Effects of pH on the activity of the protease

將此蛋白酶在不同pH值，40 ℃水浴不同時(shí)間測(cè)定其酶活力，如圖9所示，在不同pH值隨著水浴時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，蛋白酶在不同pH值保溫120 min時(shí)，相對(duì)酶活力最高的是pH 7.0，然后依次是pH 7.5、6.0、6.5、8.0、8.5、9.0，故此蛋白酶屬于中性蛋白酶。

2.5.3 金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響

圖10 金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響Fig. 10 Effects of metal ions on the activity of the protease

如圖10所示，F(xiàn)e3+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、K+和Na+對(duì)蛋白酶呈現(xiàn)出抑制作用，且呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)。Mn2+對(duì)蛋白酶活力呈現(xiàn)促進(jìn)作用，酶活力是不添加金屬離子時(shí)的（3.46±1.07）倍。添加Ca2+時(shí)，蛋白酶的酶活力是不添加金屬離子時(shí)的（0.80±0.1）倍，這可能是由于鈣蛋白酶抑制蛋白與鈣蛋白酶結(jié)合，降低鈣蛋白酶活力。真菌中的中性蛋白酶，一般可以被金屬離子螯合劑抑制[26]。

2.5.4 金屬離子對(duì)蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

表3 金屬離子對(duì)蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of metal ions on the secondary structure of the protease

樣品蛋白質(zhì)量濃度為0.09 mg/mL，不同金屬離子對(duì)蛋白酶結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如表3所示，Mn2+促進(jìn)蛋白酶活，使蛋白酶的α-螺旋增加，β-折疊減少，β-轉(zhuǎn)角增加和無(wú)規(guī)則卷曲減少?？赡苓@種結(jié)構(gòu)變化促進(jìn)蛋白酶與底物結(jié)合，使得蛋白酶呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。Ca2+使蛋白酶的α-螺旋減少，β-折疊增加，β-轉(zhuǎn)角增加和無(wú)規(guī)則卷曲增加。Na+是影響酶活的重要因素，Na+使蛋白酶α-螺旋增加，β-折疊增加，β-轉(zhuǎn)角增加和無(wú)規(guī)則卷曲減少。K+、Cu2+、Fe2+也均使蛋白酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化。Fe3+幾乎完全抑制了蛋白酶的酶活，F(xiàn)e3+使蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的改變，其中α-螺旋由22.71%下降到9.60%，β-折疊增加了7.74%，無(wú)規(guī)則卷曲增加了16.05%，β-轉(zhuǎn)角減少了2.03%，如此巨大的結(jié)構(gòu)變化使得該蛋白酶的結(jié)構(gòu)紊亂，酶活幾乎喪失。米曲霉中一種中性蛋白酶在NaCl的環(huán)境中，半衰期增加，這是由于在高鹽環(huán)境中中性蛋白酶的吉布斯自由能和活化能均升高的原因，同時(shí)，在加入NaCl后中性蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋也發(fā)生明顯變化。雖然高鹽環(huán)境改變了蛋白酶原本的結(jié)構(gòu)，但是半衰期的延長(zhǎng)也具有一定的應(yīng)用價(jià)值。2.5.5 蛋白酶的動(dòng)力學(xué)特征

根據(jù)1/S-1/V的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線（圖11），計(jì)算得到蛋白酶水解酪蛋白時(shí)米氏常數(shù)Km為2.43 g/L，最大反應(yīng)速率Vm為103.09 mg/（L·min）。Km值較低，表明此蛋白酶與酪蛋白親和力較高，蛋白酶的活性中心容易與酪蛋白結(jié)合生成酶-底物復(fù)合中間體。

圖11 蛋白酶的雙倒數(shù)曲線Fig. 11 Lineweaver-Burk plot of the protease

2.5.6 蛋白酶的耐鹽性

圖12 鹽度對(duì)蛋白酶活力的影響Fig. 12 Effect of salinity on the activity of the protease

由圖12可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度的上升，蛋白酶活力呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，酶液中NaCl質(zhì)量濃度分別為5、10 g/100 mL和15 g/100 mL時(shí)，相對(duì)酶活力分別為77.22%、54.39%和41.15%。鹽度是影響酶活力的重要因素，醬油大曲中提取的粗酶液，在18% NaCl環(huán)境中酶活力僅能保持大約3%[27]。有學(xué)者從米曲霉LK-101中純化得到一種耐鹽蛋白酶，該蛋白酶在5、10 g/100 mL和15 g/100 mL NaCl環(huán)境中酶活力分別能保持80%、50%以及30%[12]。曲霉菌FC-10中純化得到的耐鹽蛋白酶，18% NaCl環(huán)境中酶活力能保持50%[28]。由此可以看出，該蛋白酶和已純化得到的耐鹽蛋白酶耐鹽性相近，即使在高鹽度的環(huán)境中也保持著較高的酶活。隨著米曲霉基因組測(cè)序的完成，米曲霉分子遺傳改造成效卓著，人溶菌酶和牛凝乳酶在米曲霉中異源表達(dá)，以及單個(gè)堿基的精準(zhǔn)敲除或者插入[29]。因此，有望將此胞外耐鹽蛋白酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)，或者異源表達(dá)，應(yīng)用于醬油工業(yè)生產(chǎn)，改善醬油風(fēng)味[30]。

3 結(jié) 論

鈣蛋白酶RIM13首次從米曲霉3.042中分離得到，高鹽環(huán)境中保持較高的酶活力。該蛋白酶的最適溫度50 ℃；穩(wěn)定溫度40 ℃；最適pH 6.5；穩(wěn)定pH 7.0。Mn2+促進(jìn)蛋白酶活，F(xiàn)e3+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、K+、Na+抑制蛋白酶活力，以上金屬離子對(duì)蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生不同程度的影響；米氏常數(shù)Km為2.43 g/L，最大反應(yīng)速率Vm為103.09 mg/（L·min）。在5、10 g/100 mL和15 g/100 mL的NaCl質(zhì)量濃度下，保留的酶活力分別為77.22%、54.39%以及41.15%。該蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)也表明，其適合應(yīng)用于醬油醬醪發(fā)酵過(guò)程，在醬油工業(yè)發(fā)酵中具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。