北沙參多糖鐵配合物的制備、結(jié)構(gòu)特征及生物活性

景永帥，張瑞娟，吳蘭芳，蘇 蕾，李 超，張丹參,*

（1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北中醫(yī)學院藥學院，河北 石家莊 050200）

北沙參又名海沙參、野沙參、遼沙參等，為傘形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. schmidt ex Miq.）的干燥根，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源，具有滋陰清肺、益胃生津等功效[1-2]。北沙參中含有多糖類、磷脂、香豆素類等多種有效成分，其中含量最多的是多糖類，也是其主要有效成分之一[2]。關(guān)于北沙參多糖的研究主要集于提取工藝和藥理活性，其中，提取工藝研究包括熱水提取[3]、超聲波輔助[4]和微波輔助提取[5]等，藥理活性報道包括抗氧化[5]和免疫調(diào)節(jié)活性[6]等。

隨著多糖研究的深入，多糖的多種生物活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，其不僅具有多方面的藥理作用，而且來源廣泛，毒副作用低，是一種理想的藥品和保健食品開發(fā)來源[7]。近年來國內(nèi)外學者利用多糖與鐵配合生成多糖鐵配合物，這類有機配合物對胃腸道刺激小、生物利用度高，并且當配合物中的鐵脫離配體多糖后，多糖的多種生物活性在體內(nèi)也可發(fā)揮功效[8]。目前，已報道的多糖鐵配合物有：土黨參多糖鐵配合物[9]、香菇多糖鐵[10]、米糠多糖鐵[11]、茶葉多糖鐵[12]、孔石莼多糖鐵[13]等，這類多糖鐵配合物可作為補鐵劑治療缺鐵性貧血癥，具有很好的臨床療效，且不良反應少[14-15]。

因此，本實驗采用三氯化鐵共熱合成法對北沙參多糖進行結(jié)構(gòu)修飾，得到北沙參多糖鐵配合物，并對其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和生物活性進行表征和分析，為北沙參多糖鐵配合物作為補鐵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北沙參購自成都本珍生物科技醫(yī)藥有限公司，河北中醫(yī)學院藥學院生藥教研室鑒定為傘形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. schmidt ex Miq.）的干燥根；透析袋（截留分子質(zhì)量500 Da） 上海綠鳥科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦味基肼、α-葡萄糖苷酶、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、各標準單糖、抗壞血酸（VC） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、FeSO4、水楊酸、過氧化氫、混和磷酸鹽、無水碳酸鈉、檸檬酸三鈉、NaOH、FeCl3、鄰菲羅啉等為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HH-2恒溫水浴鍋、DF-2磁力加熱攪拌器 江蘇金壇宏華儀器廠；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化株式會社；KS-300DE超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；400Y多功能中藥粉碎機 永康市鉑歐玉金制品有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津儀器制造有限公司；101-2AB電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-15B高速離心機 上海安亭科學儀器廠；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；S-100傅里葉變換紅外光譜儀 珀金埃爾默儀器有限公司；JEM-2100透射電鏡 日本Jeol公司；ICS-2500高效陰離子交換色譜-電流安培檢測器（high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD） 美國戴安公司；STD-2960差熱-熱重聯(lián)用熱分析儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 北沙參多糖及其鐵配合物的制備

1.3.1.1 北沙參多糖的制備

取北沙參藥材，粉碎，過40 目篩，用3 倍體積的95%乙醇溶液回流提取2 次，藥渣干燥后，備用。取25 g北沙參除脂后粉末，加入30 倍體積的蒸餾水，于恒溫水浴鍋中回流提取2 h，提取2 次，分別將上清液8 000 r/min離心4 min，抽濾后合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至小體積，用等體積的無水乙醇將濃縮液進行醇沉，靜置過夜，抽濾，沉淀干燥即得北沙參多糖。

1.3.1.2 北沙參多糖鐵配合物的制備

稱取2.0 g北沙參多糖，在三口瓶中用100 mL蒸餾水溶解，加入0.5 g檸檬酸三鈉，在70 ℃的水浴中持續(xù)攪拌，同時滴加20% NaOH和2 mol/L FeCl3溶液，控制反應體系pH值在8.0～9.0之間，當體系中生成不溶的棕紅色沉淀時，停止滴加NaOH和FeCl3溶液，繼續(xù)攪拌反應1 h，趁熱8 000 r/min離心4 min，取上層棕紅色液體，用4 倍體積的無水乙醇醇沉，抽濾，收集沉淀，沉淀用適量的蒸餾水溶解，放入500 Da的透析袋中，用流水和蒸餾水分別透析24 h，濃縮，干燥，即得多糖鐵配合物[11]。

1.3.2 北沙參多糖及其鐵配合物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征

1.3.2.1 北沙參多糖的單糖組成分析

分別稱取2.0 mg的各單糖標準品（L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖），配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，量取20.0 μL進行HPAEC-PAD測定。稱取北沙參多糖樣品2.0 mg，加入2.0 mL的2 mol/L的三氟乙酸溶液，于110 ℃條件下水解6 h，加適量甲醇減壓濃縮，去除剩余三氟乙酸，加入蒸餾水溶解，取20.0 μL進行HPAEC-PAD測定，根據(jù)各峰的保留時間和峰面積比計算出樣品的單糖組成和物質(zhì)的量比[16]。

1.3.2.2 鐵離子含量測定

鐵離子含量標準曲線的繪制：分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3.0 mL的10 mg/L的FeSO4標準溶液于試管中，加入2.0 mL的10% VC溶液和2.5 mL的0.1%鄰菲羅啉溶液，加蒸餾水至10 mL，搖勻，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應10 min，紫外-可見分光光度計在510 nm波長處測定吸光度。以Fe2+質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

多糖鐵配合物中鐵離子含量測定：取1.0 mL的0.08 mg/mL的多糖鐵配合物溶液、2 mL的10% VC溶液和2.5 mL的0.1%鄰菲羅啉溶液加入到試管中，加蒸餾水至10 mL，搖勻，37 ℃恒溫反應1 h，于510 nm波長處測定吸光度，將結(jié)果帶入標準曲線，計算多糖鐵配合物中Fe3＋質(zhì)量濃度C/（mg/mL），按公式（1）計算多糖鐵配合物中鐵質(zhì)量分數(shù)S[11]：

1.3.2.3 紫外-可見光譜分析

分別配制0.1 mg/mL的北沙參多糖和多糖鐵配合物溶液，用紫外-可見分光光度計在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描[17]。

1.3.2.4 紅外光譜分析

分別稱取1.0 mg的北沙參多糖和多糖鐵配合物，與KBr按1∶1比例混合，研磨成粉末，壓片，在紅外光譜儀上在4 000～500 cm－1范圍內(nèi)掃描[18-19]。

1.3.2.5 透射電鏡掃描

取1.0 mg的多糖鐵配合物樣品，加入無水乙醇，超聲5 min使其分散，再將其滴于有支撐膜的銅網(wǎng)上，常溫放置至干燥后進行透射電鏡觀察[20]。透射電鏡最大放大倍數(shù)：106倍，分辨率：0.14 nm，加速電壓：120 kV。

1.3.2.6 熱重分析

分別稱取2.0 mg的北沙參多糖和多糖鐵配合物，溫度由室溫升至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進行熱重分析，包括差示掃描量熱分析（differential scanning calorimetry，DSC）和熱解重量分析（thermal gravimetric analysis，TGA）。以溫度為X軸，以質(zhì)量損失率（某一溫度下質(zhì)量損失后樣品的實測質(zhì)量與樣品總質(zhì)量的比值）為Y軸，繪制熱重變化曲線[21]。

1.3.3 北沙參多糖及其鐵配合物的生物活性

1.3.3.1 清除羥自由基活性

北沙參多糖和多糖鐵配合物清除羥自由基的測定參照文獻[22]方法。

1.3.3.2 對α-葡萄糖苷酶抑制活性

分別取3 mL的pH 6.81緩沖溶液、0.8 mL的2 mmol/L PNPG溶液，37 ℃恒溫孵育20 min，加入1 mL 40 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，繼續(xù)反應20 min，加入1 mL 1.0 mol/L碳酸鈉溶液終止反應，用紫外-可見分光光度計在400 nm波長處測吸光度，作為對照組，為A1，平行測定3 次。將體系中的1 mL α-葡萄糖苷酶換為1 mL蒸餾水，其余溶液不變，在相同的條件下測定吸光度，作為空白組，為A2。

取2 mL pH 6.81緩沖溶液、0.8 mL 2 mmol/L PNPG溶液，分別加入1 mL質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5 mg/mL的多糖樣品溶液，同上進行反應。反應完畢后于400 nm波長處測吸光度，作為樣品組，為A3，平行測定3 次。將體系中1 mL的α-葡萄糖苷酶換為1 mL蒸餾水，其余溶液不變，在相同的條件下測定吸光度，作為樣品對照組，為A4[23]。阿卡波糖作為陽性對照品。按公式（2）計算抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 北沙參多糖的提取率和單糖組成分析

圖1 標準單糖的高效陰離子交換色譜圖Fig. 1 HPAEC-PAD chromatograms of standard monosaccharides

圖2 北沙參多糖完全酸水解的高效陰離子交換色譜圖Fig. 2 HPAEC-PAD chromatograms of GLP

北沙參經(jīng)乙醇除脂、水提醇沉法制備后，得到北沙參多糖為4.6 g，提取率為18.4%。北沙參多糖經(jīng)完全酸水解后，用HPAEC-PAD分析，與標準單糖的高效陰離子交換色譜保留時間和峰面積對照（圖1、2），結(jié)果表明：北沙參多糖由葡萄糖和甘露糖組成，其物質(zhì)的量比為1.00∶4.25。

2.2 北沙參多糖及其鐵配合物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 多糖鐵配合物中鐵含量測定

根據(jù)標準曲線得到標準曲線方程：y=0.150 7x+0.005 2，R2=0.996 8，其中y為吸光度，x為Fe2+質(zhì)量濃度。由標準曲線方程計算鐵含量，北沙參多糖鐵配合物中鐵質(zhì)量分數(shù)為19.31%。

2.2.2 紫外-可見光譜圖譜分析

圖3 北沙參多糖（a）和多糖鐵配合物（b）紫外-可見光譜圖譜Fig. 3 UV-visible spectra of GLP (a) and GLP-Fe (b)

由圖3可知，北沙參多糖在260 nm和280 nm波長處無吸收峰出現(xiàn)，說明樣品中不含有核酸和蛋白質(zhì)。在紫外區(qū)，多糖鐵配合物的吸收強度明顯比北沙參多糖的吸收強度強，推測可能為鐵離子與多糖中的羥基發(fā)生了絡合反應[24]。

2.2.3 紅外光譜分析

圖4 北沙參多糖（a）和多糖鐵配合物（b）紅外圖譜Fig. 4 Infrared spectra of GLP (a) and GLP-Fe (b)

由圖4可看出，修飾前后的紅外圖譜主要特征吸收峰未發(fā)生顯著改變，說明鐵配合物修飾未破壞其基本結(jié)構(gòu)[11]。3 400 cm－1附近為多糖分子中羥基的伸縮振動吸收峰，修飾后，峰形發(fā)生變化，可能因多糖的羥基參與了絡合反應[24]，這與紫外-可見光譜分析結(jié)果相一致；1 600 cm－1左右為C＝O的伸縮振動吸收峰，修飾后吸收峰減弱，可能是多糖的C＝O與鐵離子配位造成的[25]；1 250～1 000 cm－1范圍內(nèi)是C—O的伸縮振動吸收，修飾后吸收峰減弱，推測可能是C—O鍵參與了多糖與鐵的絡合，或是因為氫鍵之間的相互作用；680 cm－1和850 cm－1附近的吸收峰增強，與文獻[26]報道的β-FeOOH的紅外光譜一致。紅外光譜圖顯示，北沙參多糖與FeCl3反應形成了多糖鐵配合物。

2.2.4 透射電鏡分析

圖5 多糖鐵配合物透射電鏡圖Fig. 5 Transmission electron microphotograph of GLP-Fe

由圖5可以看出，黑色斑點是鐵核，外圍電子透明的亮區(qū)即北沙參多糖，鐵核在多糖中分布較分散，大小不一，還比較規(guī)則，直徑在100～200 nm范圍。由圖5C可看到，出現(xiàn)衍射光斑，光斑呈環(huán)狀分布[26]。由透射電鏡和紅外光譜結(jié)果可知，多糖鐵配合物是以聚合的β-FeOOH微核為核心，多糖在其表面配合形成的多糖鐵（Fe3+）表面配合物。

2.2.5 熱重分析結(jié)果

2.2.5.1 北沙參多糖熱重分析

圖6 北沙參多糖的熱重曲線圖Fig. 6 Thermogravimetric curve of GLP

由圖6的DSC曲線（虛線）可知，圖譜主要特征為有1 個吸熱峰1 個放熱峰，53 ℃的吸熱峰是由多糖中的吸附水升華引起的，300.84 ℃為多糖分解的放熱峰。由TGA曲線（實線）可知，北沙參多糖的熱分解曲線分為兩個階段，第1個階段為27～160 ℃，此階段失去的主要是水，質(zhì)量損失率為7.399%；第2個階段為160～800 ℃，在270～350 ℃區(qū)間，多糖快速質(zhì)量損失，在350～800 ℃質(zhì)量損失速度減慢，此階段的質(zhì)量損失率為66.7%，說明在該溫度區(qū)域，多糖發(fā)生了分解，化學鍵受到了破壞[27]。

2.2.5.2 多糖鐵配合物熱重分析圖

由圖7的DSC曲線（虛線）可知，多糖鐵配合物主要特征為有2 個吸熱峰1 個放熱峰，55 ℃的吸熱峰可能是因為多糖鐵復合物中的吸附水升華引起的， 288.58 ℃有一個放熱峰，596.99 ℃有一個小的吸熱峰。由TGA曲線（實線）可知，多糖鐵配合物的熱分解曲線分為3 個階段，第1個階段是32～150 ℃，此階段失去的主要是水，質(zhì)量損失率為10.65%；第2個階段是150～550 ℃，此階段質(zhì)量損失率為41.45%，說明在該溫度區(qū)域，多糖發(fā)生了分解，化學鍵受到了破壞；第3個階段是550～800 ℃，質(zhì)量損失率為11.78%。

圖7 多糖鐵配合物的熱重曲線圖Fig. 7 Thermogravimetric curve of GLP-Fe

結(jié)合TGA曲線和DSC曲線可知，55 ℃的吸熱峰是由于樣品中的吸附水升華引起的，DSC中288.58℃的放熱峰和TGA中300 ℃左右的質(zhì)量損失峰高度關(guān)聯(lián)，說明288.58 ℃的放熱峰是可能是多糖鐵配合物分解失去結(jié)晶水和鐵核的相轉(zhuǎn)化引起的[25]。綜上所述，經(jīng)鐵修飾后，多糖的熱分析曲線趨勢比較緩和，說明修飾后的多糖的穩(wěn)定性有所提高。

2.3 北沙參多糖及其鐵配合物的生物活性

2.3.1 清除羥自由基作用

圖8 北沙參多糖和多糖鐵配合物對羥自由基清除作用Fig. 8 Hydroxyl radical scavenging effect of GLP and GLP-Fe

從圖8可知，北沙參多糖及其鐵配合物對羥自由基均有一定的清除作用，樣品質(zhì)量濃度不同，對羥自由基的清除作用也不同，整體呈線性關(guān)系。北沙參多糖的IC50值為6.413 mg/mL，多糖鐵配合物的IC50值為0.057 mg/mL，VC的IC50值為0.047 mg/mL，IC50值越小，清除作用越好。鐵修飾后的多糖鐵配合物的活性顯著提高。先宏等[28]合成褐藻硫酸多糖鐵配合物，何瑞雪等[29]合成大豆多糖鐵配合物，并對其抗氧化活性進行考察，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鐵修飾后，抗氧化活性明顯增強，和本研究的結(jié)果相一致。

2.3.2 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

圖9 北沙參多糖和多糖鐵配合物對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig. 9 α-Glucosidase inhibitory effect of GLP and GLP-Fe

從圖9可看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，北沙參多糖和多糖鐵配合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也逐漸增強，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。當質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，北沙參多糖及其鐵配合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為23.6%和69.35%，鐵修飾后，抑制率明顯增強，但均低于陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率。杜國豐等[30]報道苦瓜多糖及其鐵配合物組均能顯著降低高血糖模型小鼠的血糖水平，且苦瓜多糖鐵降血糖效果更顯著，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié) 論

選用北沙參為原料，采用水提醇沉法制備北沙參多糖。對制備的多糖進行鐵配合物修飾。采用紫外-可見光譜、紅外光譜、HPAEC-PAD、透射電鏡、DSC和TGA等對多糖及其鐵配合物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征等進行評價，從清除羥自由基和對α-葡萄糖苷酶的抑制活性兩個方面進行生物活性測試，得出以下結(jié)論：1）北沙參多糖的提取率為18.4%，是由葡萄糖和甘露糖組成，其物質(zhì)的量比為1.00∶4.25，不含有核酸和蛋白質(zhì)。2）多糖鐵配合物中鐵離子質(zhì)量分數(shù)為19.31%，是以聚合的β-FeOOH微核為核心，多糖在其表面配合形成的多糖鐵（Fe3+）表面配合物。3）北沙參多糖經(jīng)鐵修飾后，對羥自由基清除作用和對α-葡萄糖苷酶的抑制能力均得到明顯提高。北沙參多糖鐵配合物具有較好的穩(wěn)定性和生物活性，有望開發(fā)成為一種具有多重保健功能的生物多糖型補鐵劑。