多黏菌素E耐藥基因mcr-1在我國養(yǎng)殖場的流行及其傳播擴(kuò)散

王政 付玉林 汪洋 江海洋

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

多黏菌素類抗生素是多黏桿菌培養(yǎng)液中提得的一組多肽類抗生素，有5種成分(A、B、C、D和E)。多黏菌素B和E被批準(zhǔn)用于人醫(yī)臨床，多黏菌素E被批準(zhǔn)用于動物[1]。多黏菌素E又稱黏菌素，在養(yǎng)殖場中通常以硫酸黏菌素預(yù)混劑的形式作為飼料添加劑來使用，用來促進(jìn)動物生長或治療由腸桿菌科細(xì)菌引起的疾病。

多黏菌素E因其嚴(yán)重的腎臟毒性和神經(jīng)毒性曾在臨床上被禁止使用，但隨著革蘭陰性菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性越來越嚴(yán)重，20世紀(jì)90年代，多黏菌素E又重新被應(yīng)用于臨床，并被認(rèn)為是臨床上治療多重耐藥陰性菌感染的最后一道防線，世界衛(wèi)生組織也已將其歸為最關(guān)鍵的抗生素之一[1-2]。在我國，多黏菌素E于20世紀(jì)80年代初批準(zhǔn)用于動物，但目前還未批準(zhǔn)用于人醫(yī)臨床。細(xì)菌對多黏菌素E產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，是細(xì)菌染色體編碼的二元調(diào)控系統(tǒng)pmrAB和phoPQ以及相關(guān)的調(diào)控基因mgrB的突變導(dǎo)致脂質(zhì)A的修飾發(fā)生改變，脂質(zhì)A與多黏菌素E之間的靜電作用力下降，從而使多黏菌素失去抗菌活性[3]。由于突變耐藥菌只能垂直傳播，所以在較長的一段時間內(nèi)，臨床調(diào)查顯示細(xì)菌對多黏菌素E的耐藥率都維持在一個較低的水平。但近年來，來源于動物養(yǎng)殖場的分離菌株對多黏菌素E的耐藥率出現(xiàn)了明顯上升，針對這一現(xiàn)象，Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，一種編碼磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的基因mcr-1，可介導(dǎo)細(xì)菌對多黏菌素E耐藥。與突變耐藥菌不同，該基因還可以發(fā)生水平傳播。流行病學(xué)調(diào)查顯示，攜帶mcr-1的細(xì)菌在動物養(yǎng)殖場已經(jīng)廣泛流行，分離率達(dá)21%，這表明mcr-1的流行是養(yǎng)殖場分離菌株對多黏菌素E的耐藥率出現(xiàn)上升的主要原因[4]。雖然目前陸續(xù)有mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5等新的mcr變體被發(fā)現(xiàn)[5]，但是，在我國介導(dǎo)細(xì)菌對多黏菌素E耐藥的基因仍然以mcr-1為主。

目前，mcr-1已在6大洲，30多個國家被發(fā)現(xiàn)，這表明mcr-1已在全球范圍內(nèi)形成了流行[6-7]。在我國，已有25個省/自治區(qū)分離到了攜帶有mcr-1的細(xì)菌。其中，在動物源細(xì)菌檢測到mcr-1的省份或直轄市有黑龍江、新疆、寧夏、河北、湖北和重慶；在人源細(xì)菌中檢測到mcr-1的省份有海南、廣西、云南、江西、山西和甘肅；在動物源和人源都檢測到了mcr-1基因的省份或直轄市有遼寧、山東、河南、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、臺灣、四川、北京、上海和天津[8-13]。一份關(guān)于我國MCR-1陽性細(xì)菌的回溯性研究表明，在養(yǎng)禽場內(nèi)MCR-1陽性細(xì)菌的分離率自2009年以來呈現(xiàn)出了逐漸上升的趨勢[14]，與此同時，在動物源性食品和醫(yī)院感染病人樣品中也都分離到了攜帶有mcr-1的細(xì)菌[4]。mcr-1能否從養(yǎng)殖場內(nèi)傳播到養(yǎng)殖場外而威脅到公共衛(wèi)生安全是研究者最關(guān)心的問題之一。為了評估m(xù)cr-1對人類公共安全的風(fēng)險，在養(yǎng)殖場開展多黏菌素E耐藥菌的流行病學(xué)調(diào)查顯得至關(guān)重要，然而現(xiàn)在還沒有針對我國養(yǎng)殖場中mcr-1流行規(guī)律的綜合報道。本篇綜述對我國養(yǎng)殖場內(nèi)mcr-1的流行規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，對養(yǎng)殖場內(nèi)MCR-1陽性細(xì)菌由場內(nèi)傳播到場外的傳播途徑進(jìn)行了歸納分析，以期找到mcr-1傳播擴(kuò)散的特點，為相關(guān)研究人員提供參考。

1 mcr-1在養(yǎng)殖場的流行特點

已有的報道顯示，mcr-1在豬場、雞場、奶牛場、淡水魚養(yǎng)殖場中都有分布，其中豬場和雞場中MCR-1陽性細(xì)菌的分離率較高[15-17]。目前分離得到的MCR-1陽性菌株都屬于腸桿菌科細(xì)菌，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、志賀氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、抗壞血酸克呂沃爾菌等[18-20]。其中，mcr-1陽性大腸埃希菌的分離率最高[21]。本文將以mcr-1陽性大腸埃希菌為代表，從分子分型，質(zhì)粒分型，基因側(cè)翼環(huán)境3個層面來介紹mcr-1基因在腸桿菌科細(xì)菌中的流行特點。

1.1 mcr-1陽性大腸埃希菌的分子分型

目前使用最多的分子分型方法是多序列位點分型(multilocus sequence typing, MLST)，從MLST分型結(jié)果來看，mcr-1陽性大腸埃希菌的ST分型多樣，沒有主要的流行型。如Wang等[6]的研究顯示，人醫(yī)臨床上MCR-1陽性細(xì)菌的ST型有ST602、ST101、ST410、ST95、ST1193、ST354、ST156、ST10、ST117、ST405、ST131和ST648等；Yang等[10]的研究顯示，雞源mcr-1陽性大腸埃希菌的ST型有ST48、ST10、ST616、ST88、ST744、ST117、ST3044、ST2491、ST2345、ST1642、ST5909和ST501等；豬源mcr-1陽性大腸埃希菌的ST型有ST1114、ST167、ST48、ST410、ST156和ST165等[22]。Zhou等[23]在浙江地區(qū)的河流中也檢測到了16株MCR-1陽性細(xì)菌，ST型分別為ST10、ST101、ST206、ST181、ST1638和ST43。盡管上述研究者報道的多種ST型菌株來源不同，但經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)有一些ST型如ST10、ST156和ST648等在人和動物中都有分布，而ST10在人、動物和水環(huán)境中都有報道[6]。還有研究顯示ST156和ST648大腸埃希菌與多重耐藥菌有關(guān)，這兩種ST型可同時含有mcr-1和blaNDM-5[24]。此外，ST648是人醫(yī)臨床上的流行性菌株，mcr-1/ST648的流行傳播會給臨床用藥帶來很大的挑戰(zhàn)[24]。

不同環(huán)境、不同來源的菌株中都分離到了MCR-1陽性菌株，且擁有多樣的ST分型，一方面說明mcr-1的傳播是依靠水平傳播元件介導(dǎo)的，另一方面也表明陽性菌株擁有很好的適應(yīng)性。在其他種屬如沙門菌中，攜帶有mcr-1的菌株ST型也多種多樣[25]，但也有報道顯示，ST34是鼠傷寒沙門菌的主要流行型[8,26]。

1.2 攜帶mcr-1的質(zhì)粒分型多樣

根據(jù)質(zhì)粒不相容性原理可以將質(zhì)粒分為不同的Inc型，同一Inc型的兩種質(zhì)粒不能共存于同一個細(xì)菌中。文獻(xiàn)報道m(xù)cr-1基因多位于質(zhì)粒上，其Inc分型有IncI2、 IncX4、IncHI1、IncHI2、IncF、IncFI、IncFII和IncP[27]。其中，IncI2和 IncX4在mcr-1陽性質(zhì)粒中最為常見。IncI2型質(zhì)粒是窄宿主質(zhì)粒，通常只存在于腸桿菌科細(xì)菌中，該型質(zhì)粒多可以發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。此外，該型質(zhì)粒也與產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因如blaCTX-M-55傳播有關(guān)[28]。IncX4是大腸埃希菌中分布最廣的質(zhì)粒之一，也是窄宿主質(zhì)粒，只能在腸桿菌科細(xì)菌中流行。該型質(zhì)粒是自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，自身含有Ⅳ型分泌系統(tǒng)，松弛酶基因和結(jié)合蛋白基因，能夠以較高的接合轉(zhuǎn)移頻率在同種細(xì)菌間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移[27]。尤其值得引起重視的是在一種廣宿主質(zhì)粒IncP中也發(fā)現(xiàn)了mcr-1[29]，這提示目前雖在腸桿菌科以外的細(xì)菌種屬中尚未檢測到mcr-1基因，但存在mcr-1傳播到其他種屬細(xì)菌中的可能。

1.3 mcr-1的傳播流行與插入序列ISApl1密切相關(guān)

mcr-1的水平傳播一方面與質(zhì)粒相關(guān)，另一方面也與mcr-1的側(cè)翼環(huán)境如插入序列相關(guān)。目前NCBI(national center for biotechnology information)上公布的含有mcr-1的序列結(jié)構(gòu)顯示mcr-1的側(cè)翼中有一段保守的序列結(jié)構(gòu)ISApl1-mcr-1-pap2。Tn6330(ISApl1-mcr-1-ISApl1)的發(fā)現(xiàn)證實mcr-1可以隨著轉(zhuǎn)座子的移動而發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[30]。Wang等[31]已報道目前mcr-1的側(cè)翼序列至少可以分為8類。這表明mcr-1在質(zhì)粒中正在經(jīng)歷一個適應(yīng)的過程，如Sun等[27]的報道中提到了mcr-1在IncX4型質(zhì)粒中有一個進(jìn)化的過程。

總的來說，MCR-1陽性細(xì)菌已在我國養(yǎng)殖場(特別是養(yǎng)禽場和養(yǎng)豬場)中廣泛流行，其傳播方式以水平傳播為主。質(zhì)粒是介導(dǎo)mcr-1水平傳播的主要元件，其可以在相同種屬甚至不同種屬的細(xì)菌間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。此外，轉(zhuǎn)座子Tn6330在mcr-1的傳播中也起到了重要作用。通過以上傳播機(jī)制，在藥物的選擇壓力下，攜帶有mcr-1的細(xì)菌得以在動物源腸桿菌科細(xì)菌廣泛傳播。

2 mcr-1的傳播擴(kuò)散

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果可以推測養(yǎng)殖場可能是mcr-1傳播擴(kuò)散的源頭，一是因為養(yǎng)殖場MCR-1陽性菌株的分離率較高，而醫(yī)院感染病人中的分離率相對較低[4]。二是因為養(yǎng)殖場和人類生活密切相關(guān)，如食源性細(xì)菌如空腸彎曲桿菌、艱難梭菌等可以通過食物鏈途徑感染人類[32-33]。MCR-1陽性菌株基本都為腸桿菌科細(xì)菌，細(xì)菌一方面可以通過污染動物源性食品來進(jìn)行傳播擴(kuò)散；另一方面，動物的排泄物通過堆肥處理后返田，也可能會污染農(nóng)作物，如蔬菜，小麥等，進(jìn)而威脅到公共安全[34]。

2.1 直接接觸或食物鏈途徑污染

mcr-1的傳播擴(kuò)散與食物鏈有關(guān)[35]，如Liu等[4]的報道中提到，從雞肉等熟食中也分離得到了攜帶有mcr-1基因的菌株，Liu等[36]調(diào)查了深圳市超市或市場上銷售的豬肉、雞肉、蝦等食品，共分離得到了109株mcr-1陽性腸桿菌細(xì)菌。這表明mcr-1基因有沿食物鏈傳播的風(fēng)險。養(yǎng)殖場內(nèi)，mcr-1通過直接接觸傳播也有文獻(xiàn)報道，如在老撾的一次流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)豬場一名飼養(yǎng)員糞便中分離的MCR-1陽性細(xì)菌，與豬糞便中分離的具有相同的脈沖場凝膠電泳(PFGE)譜型，提示該菌在動物和人之間發(fā)生了克隆傳播[37-38]。

2.2 其他傳播媒介

除食物鏈途徑外，環(huán)境介導(dǎo)的傳播，如水環(huán)境，土壤等[23,39]，也漸漸引起了人們的關(guān)注。其中養(yǎng)殖場污染物對周圍環(huán)境的影響是人們研究的熱點之一?，F(xiàn)代化養(yǎng)殖場普遍采樣高密度的動物養(yǎng)殖模式，而養(yǎng)殖場囤積的糞便污染物的處理一直是一個難題。動物的糞便一方面殘留有抗菌藥物或其活性代謝產(chǎn)物，同時也含有豐富的耐藥菌或耐藥基因。在動物糞便中就殘留有多黏菌素E的活性代謝產(chǎn)物[40-41]。在我國，很多養(yǎng)殖場會通過堆肥的方式處理糞便，然后施用到農(nóng)田中。堆肥雖然是有機(jī)肥料，但堆肥的使用也伴隨著耐藥基因或耐藥菌隨堆肥進(jìn)入到了環(huán)境中，進(jìn)而影響到人類[42-43]。我國是養(yǎng)豬大省，據(jù)統(tǒng)計，每年豬場大概會產(chǎn)生6億噸堆肥，這不容忽視[44]。已有文獻(xiàn)報道在豬場環(huán)境(土壤、堆肥等)中就分離得到了攜帶有mcr-1的細(xì)菌[45-46]。

除了堆肥等環(huán)境媒介可以促進(jìn)耐藥菌發(fā)生水平傳播以外，一些重要的生物傳播媒介如蒼蠅等對耐藥菌的傳播也可能起到促進(jìn)作用。Wang等[47]的研究表明，blaNDM在肉雞生產(chǎn)鏈條中的傳播擴(kuò)散與蒼蠅密切相關(guān)。揚(yáng)州大學(xué)Zhang等[48]的研究也表明蒼蠅在耐藥基因傳播過程當(dāng)中起到的中介作用。

綜上所述，養(yǎng)殖場內(nèi)的MCR-1陽性細(xì)菌可能通過食物鏈或環(huán)境介質(zhì)等由養(yǎng)殖場向養(yǎng)殖場外傳播擴(kuò)散，雖然目前還沒有直接的證據(jù)證明mcr-1可以通過這些途徑感染人群，但潛在風(fēng)險不容忽視，Wang等[6]的研究就顯示MCR-1陽性菌株的定植與病人生活地距離養(yǎng)殖場的遠(yuǎn)近有關(guān)系。

3 結(jié)論與展望

本文綜述了mcr-1在我國養(yǎng)殖場的流行傳播特點，簡要闡明了其傳播流行的機(jī)制，同時歸納了MCR-1陽性菌株由養(yǎng)殖場向養(yǎng)殖場外傳播擴(kuò)散的可能途徑。由于攜帶mcr-1的質(zhì)粒的多樣性和良好的適應(yīng)性，mcr-1在腸桿菌科細(xì)菌中形成了廣泛流行，存在著由養(yǎng)殖場傳播到養(yǎng)殖場外的風(fēng)險。人們生活在同一個地球上，對抗耐藥菌需要全世界的共同努力。目前，已有國家和地區(qū)采取了相應(yīng)的措施來限制多黏菌素耐藥菌的擴(kuò)散傳播，如我國農(nóng)業(yè)部已在第2428號公告中明確提出，2017年4月30號前，硫酸黏菌素預(yù)混劑在養(yǎng)殖場將被禁止作為飼料添加劑來使用，在英國和歐盟也有類似的措施實施[1]。

限制多黏菌素E在養(yǎng)殖場的使用的只是防控細(xì)菌耐藥性的第一步，還有很多問題需要人們?nèi)ソ鉀Q。對科研工作者來說，評估多黏菌素E的使用對MCR-1陽性菌株在養(yǎng)殖場傳播擴(kuò)散的影響以及對人類公共安全的威脅需要盡快完成；同時，在動物和人醫(yī)臨床上的耐藥性監(jiān)控需要繼續(xù)加強(qiáng)，爭取能形成定期的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)控；此外，探索有效經(jīng)濟(jì)的污染物處理方法也十分重要。就養(yǎng)殖場來說，應(yīng)該規(guī)范養(yǎng)殖場的用藥制度，明確獸醫(yī)在養(yǎng)殖場的責(zé)任和義務(wù)。只有共同努力，我們才能更好的應(yīng)對超級細(xì)菌帶來的風(fēng)險。