2015—2017年中山市某醫(yī)院沙門菌的藥敏分析及腸毒素基因檢測(cè)

向蓉 陳榮忠 黃雪珍

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗(yàn)科，中山 528415)

沙門菌屬是一類重要的人畜共患病原菌，具有分布廣泛、抗原位點(diǎn)復(fù)雜及血清型繁多等生物學(xué)特征。近年來(lái)，由于抗菌藥物的不規(guī)范使用，導(dǎo)致沙門菌株耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，而食物供應(yīng)冷鏈技術(shù)的快速發(fā)展，使非傷寒沙門菌(nontyphoidalSalmonella,NTS)的感染在諸多食源性疾病中與日俱增，已成為全球性關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2]。本研究通過(guò)回顧性分析2015年1月—2017年12月中山市小欖人民醫(yī)院住院患者沙門菌的血清分型、藥物敏感試驗(yàn)和腸毒素基因，為控制中山市西北部區(qū)域沙門菌的感染提供流行病學(xué)調(diào)查依據(jù)。

1 資料與方法

一般資料 收集我院2015年1月—2017年12月因發(fā)熱、腹瀉等癥狀就診的患者糞便標(biāo)本4019份，其中經(jīng)糞便培養(yǎng)證實(shí)為沙門菌感染患者為108例，年齡0～72歲，同一患者同一種菌株不計(jì)在內(nèi)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀及其配套GN鑒定卡、AST-GN13藥敏卡(法國(guó)Bio-Mérieux公司)，凝膠成像儀系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國(guó))，2720 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，WD-9403C紫外儀(六一儀器廠，北京)，DYY-2C型電泳儀(六一儀器廠，北京)。

1.2.2 主要試劑

哥倫比亞血平板、麥康凱培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣州市迪景微生物科技有限公司，抗菌藥敏紙片為英國(guó)Oxoid公司，沙門志賀增菌肉湯購(gòu)自江門市凱林貿(mào)易有限公司，沙門菌屬診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司，瓊脂糖購(gòu)自賽國(guó)生物科技，100bp DNA Ladder，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、spvA，spvB，rck引物合成、DNA Mark、Premix溶液(包含Mg2+、Taq酶、dNTPs)等PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑均購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌(ATCC27853)，大腸埃希菌(ATCC25922)均購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及血清分型

標(biāo)本的采集、運(yùn)送及分離培養(yǎng)均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。糞便標(biāo)本經(jīng)沙門志賀增菌肉湯增菌后，接種于哥倫比亞血平板、麥康凱培養(yǎng)基及XLD培養(yǎng)基，經(jīng)35℃培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)18～24h，挑取XLD培養(yǎng)基上可疑的黑色菌落，經(jīng)VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定。若鑒定結(jié)果為沙門菌，則根據(jù)K-W血清分型表進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

采用2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)指南推薦的紙片擴(kuò)散法和自動(dòng)化儀器對(duì)已分型的沙門菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。由于沙門菌和志賀菌對(duì)氨基糖苷類，第一、二代頭孢菌素和頭霉素可能在體外試驗(yàn)顯示活性，但臨床治療無(wú)效，不應(yīng)報(bào)告為敏感。本研究選擇以下10種抗菌藥物：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、哌拉西林/三唑巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑和亞胺培南。多重耐藥定義：對(duì)3類及以上抗菌藥物耐藥的菌株。本文設(shè)定為對(duì)氨芐西林、氨曲南、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑及第三代頭孢菌素其中3類及以上抗菌藥物耐藥的沙門菌為多重耐藥。

1.3.3 腸毒素基因檢測(cè)

根據(jù)GenBank公布的關(guān)于沙門菌屬的腸毒素基因(spvA,spvB,rck)序列設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物(表1)，嚴(yán)格按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的要求進(jìn)行DNA的提取。通過(guò)PCR方法對(duì)3種腸毒素基因進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，總反應(yīng)體系為20μL ，PCR預(yù)混合試劑10μL，擴(kuò)增引物各1.0μL，模板DNA 2μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足20μL； PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性3min，94℃變形30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。采用2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，確定菌株是否含有相應(yīng)腸毒素基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 沙門菌腸毒素基因的PCR擴(kuò)增引物Tab.1 PCR amplification primer for Salmonella enterotoxin gene

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；應(yīng)用WHONET 5.6軟件對(duì)沙門菌株的藥敏結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料調(diào)查

2015年1 月—2017年12月共收集糞便標(biāo)本4019份，檢出沙門菌108株，陽(yáng)性率為2.69%。男性患者68例，女性患者40例，男女比例為1.7:1。不同年齡段患者構(gòu)成情況如下：≤1歲(嬰兒)分離出沙門菌50株，占46.30%(50/108)；1～3歲(幼兒)占37.04%(40/108)；3～18歲(兒童)占4.63%(5/108)；≥18歲(成人)占12.04%(13/108)，沙門菌感染以嬰幼兒多見(jiàn)。

全年不同月份均有沙門菌的檢出，其檢出率各不相同(圖1)。1～3月(冬季)沙門菌的檢出率為0.79%(8/1016)；4～6月(春季)的檢出率為2.39%(19/794)；7～9月(夏季)的檢出率為4.32%(47/1089)；10～12月(秋季)的檢出率為3.04%(34/1120)。沙門菌在不同季節(jié)的檢出率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.852，P＜0.05)，感染患者主要集中在夏秋季，具有較典型的季節(jié)性特征。

圖1 2015—2017年沙門菌的檢出數(shù)量Fig. 1 Number of detected Salmonella from 2015 to 2017

2.2 沙門菌血清型分布

108株沙門菌經(jīng)血清學(xué)鑒定，可分為4個(gè)血清群，共17個(gè)血清型 ，其中以B群和D群為主，分別占67.59%和26.85%；B群以鼠傷寒沙門菌和斯坦利沙門菌居多，D群以腸炎沙門菌和都柏林沙門菌多見(jiàn)；檢出傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌和丙型副傷寒沙門菌各1株。不同血清型沙門菌分布詳見(jiàn)表2。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

對(duì)108株沙門菌進(jìn)行10種抗菌藥物的體外敏感試驗(yàn)(表3)，此次實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)對(duì)亞胺培南及哌拉西林/三唑巴坦的耐藥菌株，耐藥率前5位分別是氨芐西林(61.11%)、氨芐西林/舒巴坦(49.07%)、頭孢曲松(25.00%)、氨曲南(24.07%)及復(fù)方磺胺甲噁唑(20.37%)。105株非傷寒沙門菌中，對(duì)10種抗菌藥物均敏感的有27株(25.71%)，對(duì)3類及以上抗菌藥物耐藥的多重耐藥菌株有38株，耐藥率為36.19%(38/105)。

表2 108株沙門菌的血清型分布Tab. 2 Serotype distribution of 108 strains of Salmonella

檢出傷寒沙門菌及乙型副傷寒沙門菌各1株，均對(duì)10種抗菌藥物敏感；1株丙型副傷寒沙門菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦及復(fù)方磺胺甲噁唑表現(xiàn)為耐藥。

2.4 腸毒素基因

采用PCR擴(kuò)增法對(duì)108株沙門菌進(jìn)行腸毒素基因檢測(cè)。其中，108株沙門菌均為spvA陽(yáng)性，34株為spvB陽(yáng)性，28株為rck陽(yáng)性(圖2～4)。根據(jù)腸毒素基因PCR擴(kuò)增結(jié)果與患者臨床癥狀進(jìn)行分組比較：spvB基因陽(yáng)性患者其高熱、便血的比率較spvB陰性患者高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.185,P＜0.05; χ2=6.13,P＜0.05)；rck基因陽(yáng)性患者其高熱、便血的比率較rck陰性患者高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=5.274,P＜0.05; χ2=8.887,P＜0.05)(表4～5)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，從4019例腹瀉患者中共分離出沙門菌108株，檢出率為2.69%，低于中山市區(qū)(5.00%)[3]與深圳地區(qū)(8.30%)[4]沙門菌的檢出率。其中于2015年檢出傷寒沙門菌、乙型副傷寒及丙型副傷寒沙門菌各1株，檢出率為0.07%，表明傷寒和副傷寒沙門菌等高致病性菌在人群中仍存在低水平的感染。中山市西北部區(qū)域非傷寒沙門菌引起的感染全年均可發(fā)生，高發(fā)季節(jié)主要集中在夏、秋兩季(7～12月)，具有明顯的季節(jié)性特征，與國(guó)內(nèi)外各地區(qū)的季節(jié)分布相似[5-6]。本組數(shù)據(jù)顯示，108例沙門菌感染病例中，男女比例為1.7:1，≤1歲嬰兒占46.30%(50/108)，1～3歲幼兒占37.04%(40/108)，以嬰幼兒感染多見(jiàn)。嬰幼兒為易感人群，可能與嬰幼兒自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，飲食結(jié)構(gòu)特殊及外在環(huán)境污染有關(guān)[7]。

表3 不同血清型沙門菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥情況(株數(shù)，%)Tab. 3 Resistance of different serotypes of Salmonella to 10 antimicrobial agents

圖2 spvA基因PCR電泳圖譜Fig. 2 PCR results for spvA gene

圖3 spvB基因PCR電泳圖譜Fig. 3 PCR results for spvB gene

圖4 rck基因PCR電泳圖譜Fig. 4 PCR results for rck gene

表4 spvB基因與患者臨床癥狀的關(guān)系Tab. 4 Relationship between spvB gene and clinical symptoms of patients

表5 rck基因與患者臨床癥狀的關(guān)系Tab. 5 Relationship between rck gene and clinical symptoms of patients

根據(jù)熱病指南建議[8]，對(duì)于無(wú)癥狀或癥狀輕微的非傷寒沙門菌感染患者可不必抗菌治療，但＜1歲或＞50歲、免疫功能低下、有特定疾病患者應(yīng)積極進(jìn)行抗菌治療。根據(jù)本次藥敏結(jié)果可看出，108株沙門菌對(duì)于頭孢曲松、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、氨曲南、亞胺培南，頭孢他啶、頭孢吡肟及哌拉西林/三唑巴坦的耐藥率均小于30%，而對(duì)氨芐西林的耐藥率則大于60%，說(shuō)明氨芐西林不宜作為經(jīng)驗(yàn)治療的首選藥物。同時(shí)，熱病指南提出，在亞洲感染的患者應(yīng)首選頭孢曲松或者阿奇霉素，不建議經(jīng)驗(yàn)使用氟喹諾酮類藥物，除非有藥敏結(jié)果指導(dǎo)。本研究顯示，沙門菌對(duì)于頭孢曲松的耐藥率為25.00%，當(dāng)經(jīng)驗(yàn)治療用藥時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎選取。非傷寒沙門菌主要通過(guò)喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)的基因突變[9]，從而降低DNA-喹諾酮類藥物-DNA旋轉(zhuǎn)酶復(fù)合物的結(jié)合水平，提高了喹諾酮類藥物的耐藥性。環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類抗菌藥物，是治療非傷寒沙門菌感染的有效抗菌藥物之一，除了QRDR基因突變以外，還可以通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)qnr基因產(chǎn)生耐藥性[10]。CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)[11]數(shù)據(jù)顯示環(huán)丙沙星耐藥率在2.4%～14.3%之間，與本文環(huán)丙沙星耐藥率(12.96%)相似，但比浙江地區(qū)[12](21.21%)及青島地區(qū)[13](18.03%)稍低。值得注意的是環(huán)丙沙星藥敏中介的菌株占13.89%(15/108)，與廣州地區(qū)[14]中介率(18.02%)相似，提示環(huán)丙沙星的藥物敏感性可能存在下降的趨勢(shì)，如果此類菌株在病房廣泛傳播，將會(huì)對(duì)疾病的抗感染治療提出嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[15]。

多重耐藥的沙門菌是近年來(lái)公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟需解決的重要問(wèn)題之一。本研究共檢出108株沙門菌，主要流行的沙門菌屬以鼠傷寒沙門菌多見(jiàn)，其次為斯坦利沙門菌和腸炎沙門菌，與中山市區(qū)[16]的血清型分布相似，但與廣州[14]、深圳[4]及浙江地區(qū)[12]存在一定差異。根據(jù)耐藥性分析結(jié)果可發(fā)現(xiàn)：近80.56%的沙門菌對(duì)至少一種抗菌藥物耐藥，35.19%的沙門菌表現(xiàn)為多重耐藥；其中鼠傷寒沙門菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率明顯高于其他血清型沙門菌，36.96%的鼠傷寒沙門菌呈現(xiàn)多重耐藥，尤其在環(huán)丙沙星藥敏中介的菌株中該菌占26.67%(4/15)。因此，圍繞沙門菌血清型分布與細(xì)菌耐藥模式的持續(xù)性監(jiān)測(cè)，有利于臨床的精準(zhǔn)治療用藥，控制耐藥菌株的產(chǎn)生。

既往研究表明，沙門菌spv基因的表達(dá)，可延長(zhǎng)細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活時(shí)間[17]、通過(guò)影響細(xì)胞因子的分泌水平[18]、下調(diào)AcrA蛋白的表達(dá)[19]等，從而增強(qiáng)沙門菌的毒力及免疫抵抗能力，有利于躲避宿主的免疫防御。其中，spvB基因是對(duì)細(xì)菌毒力影響因素較大的結(jié)構(gòu)基因之一。與此同時(shí)，侵襲因子rck可通過(guò)對(duì)人類補(bǔ)體的拮抗作用，從而增強(qiáng)沙門菌的侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，從臨床分離的108株沙門菌中，spvA基因陽(yáng)性為108株(陽(yáng)性率100%)，spvB基因陽(yáng)性為34株(陽(yáng)性率31.48%)，rck基因陽(yáng)性為28株(陽(yáng)性率25.93%)，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道相符[12]。spvB基因和(或)rck基因陽(yáng)性患者，其高熱、便血的比率均顯著高于陰性患者，提示spvB基因及rck基因的表達(dá)，可加重患者的感染癥狀，甚至可引起全身性感染。

綜上所述，沙門菌感染是腹瀉患者的重要細(xì)菌性病原體之一，早期診斷及合理用藥是控制感染擴(kuò)散的關(guān)鍵。建立持續(xù)有效的細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)體系，加強(qiáng)菌株的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，及時(shí)分析菌株的藥敏特征及其相關(guān)基因，有助于進(jìn)一步評(píng)估沙門菌感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，減少多重耐藥菌株的產(chǎn)生。