桶裝水銅綠假單胞菌污染原因及檢測方法

周 鶴 張國利 傅志豐 許文蓓

（1.九江市食品藥品檢驗所 江西九江 332000；2.九江市食品檢驗檢測中心）

1 前言

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）又稱綠膿桿菌（以下簡稱PA），是一種非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于水、土壤、空氣及動物機體和皮膚中，對紫外線、消毒劑等不良環(huán)境的抵抗力強，是一種重要的食源性條件致病菌，正常人不易感染，然而對于一些特殊人群，如術(shù)后病人以及嬰幼兒，如果接觸該菌易導(dǎo)致急性腸道炎、腦膜炎和敗血癥等疾病[1]，嚴重威脅人們的身體健康。

桶裝水是指采用自來水或地下水，經(jīng)過現(xiàn)代工業(yè)技術(shù)加工的純凈水或礦泉水。近年來，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，人們對食品的消費要求也越來越高，桶裝水因其購買、飲用便捷的特點，越來越受到大眾的歡迎。據(jù)統(tǒng)計，2010年我國桶裝水消費規(guī)模為2.9×1010元，2017年增長至7.6×1010元，市場規(guī)模增加了1.6倍[2]。然而，在發(fā)展的同時，桶裝水也存在眾多問題，近年來有關(guān)PA污染水的報道逐漸增多。2019年1月，《消費者報道》顯示，2014年至2018年，國家及省級食品藥品監(jiān)督管理局共抽檢出2 350批次不合格的桶裝水，其中，1 551批次檢出PA，占比達60.8%[3]。2018年，九江市也抽檢桶裝水25批次，其中有13批次PA不合格。因此，PA是桶裝水最突出的質(zhì)量安全問題。本文就其污染原因進行闡述，并簡要介紹了當前水中PA檢測常用的幾種方法，為生產(chǎn)實踐提供理論技術(shù)支撐。

2 PA污染原因

2.1 水源污染

水源污染可能是桶裝水受PA污染的根本原因。桶裝水主要以自來水、井水或江河湖泉水作為水源。近年來，我國經(jīng)濟在高速發(fā)展的同時，存在各種工業(yè)廢水和生活污水未處理達標就直接排放至水體的現(xiàn)象。據(jù)馬群飛等[4]的調(diào)查顯示，福建省投入生產(chǎn)的80處飲用天然礦泉水水源中，有18處檢出了PA，檢出率為23.08%。鄧梅清等[5]對南方地區(qū)45份進行檢查，也發(fā)現(xiàn)有11份檢出PA，高于成品水的14.4%，其中在成品水檢出的4家中有3家水源受到污染。如果水源受到污染，后續(xù)工藝又無法將其去除，就容易產(chǎn)生持續(xù)性污染。

2.2 生產(chǎn)過程控制有待提高

桶裝水的生產(chǎn)工藝流程為：水源水→粗濾→精濾→去離子化→[離子交換、反滲透（適用于純凈水）及其他加工方法]→配料（適用于其他飲用水）→殺菌→灌裝封蓋[瓶（桶）及其蓋的清洗消毒]→燈檢→成品。在生產(chǎn)過程中儀器設(shè)備污染、殺菌工藝參數(shù)設(shè)置不當、灌裝車間環(huán)境不達標、人員操作不規(guī)范等都有可能導(dǎo)致產(chǎn)品檢測結(jié)果不合格。其中，前3點是生產(chǎn)過程中造成污染的主要因素。

2.2.1 儀器設(shè)備污染

水處理系統(tǒng)并不是完全密封的，水罐、砂罐和活性炭罐都通過呼吸器與外界相通，細菌很容易侵入管道系統(tǒng)。PA對環(huán)境耐受力強，迅速地黏附在水生產(chǎn)所用的器具如儲水罐、管道、灌裝機、濾膜和增壓泵上，簡單的沖洗、常規(guī)的消毒技術(shù)難以對其清除。陳水仙等[6]對福建某企業(yè)桶裝水PA污染進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蓄水池中含有大量的PA，是該企業(yè)的原始污染源。在潮濕的環(huán)境下PA更易繁殖，隨著生產(chǎn)線進入下一環(huán)節(jié)，并可能蔓延至全工序的管道、設(shè)備，造成交叉污染。除此之外，部分企業(yè)對石英砂、活性炭等過濾裝置長期不清洗消毒，精濾過程的濾膜不及時更換，有的長達5年未做任何清洗或更換，一旦污染難以消除。

2.2.2 殺菌工藝參數(shù)設(shè)置不當

目前，桶裝水常采用通臭氧的方式消毒殺菌，通入臭氧能有效降低水中PA的濃度。然而，如果水中溴化物濃度過高，過量臭氧的通入將導(dǎo)致溴酸鹽超標。張永清等[7]報道，隨著臭氧濃度和溴離子濃度的增加，水中溴酸鹽生成量增加；當臭氧質(zhì)量濃度為0.4 mg/L、作用時間為5min時，選用的3種礦泉水的溴酸鹽含量均大于國標要求10 μg/L。因此，企業(yè)為避免溴酸鹽超標，必須降低臭氧的投加濃度和接觸時間，而PA對消毒劑的抵抗力遠大于其他微生物[8]，當水中PA含量較高時，容易造成殺菌不徹底的現(xiàn)象。

2.2.3 灌裝車間環(huán)境不達標

《飲用水的生產(chǎn)許可證審查細則》對桶裝水的生產(chǎn)環(huán)境要求做了具體規(guī)定：灌裝車間空氣潔凈度須達到10 000級且局部應(yīng)達到100級，或整體潔凈度達到1 000級，然而許多企業(yè)空氣清潔度難以持續(xù)保持。另外，水生產(chǎn)車間環(huán)境潮濕、常有積水，容易滋生PA，并通過罐裝進入水中。汪華等[9]調(diào)查了衡陽市周邊43家桶裝飲用水工廠灌裝間及其他主要生產(chǎn)環(huán)節(jié)PA污染情況，發(fā)現(xiàn)罐裝車間普遍存在污染，PA檢出率為83.7%，顯著高于其他生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

2.2.4 人員操作不規(guī)范

生產(chǎn)人員如果沒有養(yǎng)成一個良好的操作習(xí)慣，違反規(guī)定洗手、更衣、消毒，或者手直接與水或者包裝材料接觸，都可能將PA帶入產(chǎn)品中。由于PA對營養(yǎng)要求不高，在桶中繁殖更容易導(dǎo)致產(chǎn)品不合格。

2.3 包裝材料清洗消毒不徹底

包裝材料清洗消毒不徹底是桶裝水受污染的又一重要因素。目前，生產(chǎn)企業(yè)一般對水桶進行回收再利用，但桶的特殊構(gòu)造，不利于清洗和消毒，加上大部分企業(yè)缺乏清洗水桶的專用設(shè)備，采用人工進行清洗。在灌裝前如消毒劑濃度過低或消毒時間不夠，或消毒方法不當，不能有效地殺滅微生物，都可能導(dǎo)致桶內(nèi)PA殘留造成交叉污染。鐘菲菲等[10]對水源、生產(chǎn)工藝、儲存容器和生產(chǎn)環(huán)境等環(huán)節(jié)進行分析，結(jié)果顯示清洗消毒的水桶是成品水PA污染的原因。另外，有些小企業(yè)生產(chǎn)工藝落后，仍手工灌裝封蓋，也可能使包裝材料受到污染。

2.4 企業(yè)食品安全意識不強，出廠檢驗如同虛設(shè)

桶裝水生產(chǎn)工藝較簡單，且運輸成本高、保質(zhì)期短，因此絕大多數(shù)企業(yè)分布在各市縣，以所在行政區(qū)內(nèi)的市場為主。很多企業(yè)都是中小型企業(yè)，設(shè)備簡陋，條件粗放，檢驗人員技術(shù)能力有待完善，造成出廠檢驗如同虛設(shè)，無法發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量問題，部分企業(yè)產(chǎn)品甚至未經(jīng)檢驗直接流入市場，造成一定的安全隱患。

2.5 運輸儲藏控制不當

桶裝水桶蓋的材料來源廣泛，很多企業(yè)為了節(jié)約成本，采用回收的廢舊聚乙烯（PE）材料制作，造成桶蓋質(zhì)量欠佳，彈性和密封性差，在運輸、流通過程中易造成提拉松動而漏水，產(chǎn)品易受到空氣中PA的污染。另一方面，桶裝水一般有數(shù)月的保質(zhì)期，企業(yè)剛生產(chǎn)的水中無銅綠假單孢菌或有極少含量，但在運輸儲藏過程中，尤其是夏秋季節(jié)（溫度較高，適合銅綠假單胞菌生長），迅速自行增殖至1×104CFU/mL，造成產(chǎn)品飲用水的不合格[11]。

3 銅綠假單胞菌檢測方法

水中銅綠假單胞菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法和新興快速檢測方法2類，其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法主要是GB 8538—2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》[12]中的濾膜法；新興快速檢測方法主要包括PCR法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP）等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法實用性、準確性強，是國標通用的方法，但存在培養(yǎng)時間長的問題，且后續(xù)生化試驗煩瑣，不能實現(xiàn)批量產(chǎn)品快速檢測；新興快速檢測方法快速、特異性強、靈敏度高、簡便省時，然而也會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

3.1 國標濾膜法

國標濾膜法是通過一定的培養(yǎng)，觀察微生物的形態(tài)特征，將疑似菌落進行生化鑒定實驗以確定結(jié)果。該方法實驗條件要求不高，可以較直觀地觀察結(jié)果，適合基層實驗室檢測。具體操作過程為：將250mL水樣用0.45 μm濾膜過濾，然后將濾膜貼至CN瓊脂平板上，于36℃培養(yǎng)48 h后對結(jié)果進行觀察。銅綠假單胞菌在CN平板上有3種形態(tài)：（1）藍色或綠色菌落，按照GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》[13]的方法可以直接判定檢出，然而現(xiàn)行國標需進行綠膿菌素驗證；（2）產(chǎn)熒光非藍綠色菌落，需進行產(chǎn)氨試驗，若產(chǎn)氨實驗為陽性，則判定樣品為陽性；（3）紅褐色不發(fā)熒光菌落，此時需進行氧化酶試驗、產(chǎn)氨試驗和金氏B試驗，如三者均為陽性，則樣品為陽性。

3.2 PCR法（聚合酶鏈式反應(yīng)）

PCR技術(shù)是在體外合適條件下，以DNA為模板，以一對人工合成的寡核苷酸為引物，在耐熱DNA聚合酶作用下特異性擴增目的DNA片段的技術(shù)。應(yīng)用PCR技術(shù)檢測食源性致病菌分為常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR等，為了提高檢測靈敏度，可采用一定的增菌方式提高目標DNA片段的濃度。張淑紅等[14]建立了常規(guī)PCR技術(shù)檢測桶裝水銅綠假單胞菌的方法，該方法包括過濾、增菌、過濾、提取DNA、電泳等步驟，整個操作過程僅約需要22 h，然而無法區(qū)分活細菌和死細菌，容易造成假陽性。為了克服這個缺點，陸星羽等[15]添加10μg/mL疊氮溴乙錠（EMA），既能有效抑制死菌PCR又不影響活菌PCR，進而實現(xiàn)了對水中活菌的檢測。相比常規(guī)PCR法，熒光定量PCR技術(shù)在反應(yīng)體系中加入熒光基團或染料，通過熒光信號的強弱反映擴增過程中模板濃度變化，具有更強的檢測靈敏度和特異性。楊滴等[16]建立實時熒光定量PCR法檢測礦泉水中的銅綠假單胞菌，根據(jù)外毒素A基因片段設(shè)計了一對特異性引物和一個TaqMan探針，特異性較好，檢測靈敏度為1×103CFU/mL。Ezra Orlofsky等[17]采用MPN 計數(shù)結(jié)合q-PCR對污水中銅綠假單胞菌落進行檢測，檢測靈敏度提高至5 CFU/L。

3.3 LAMP檢測法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由 Notomi等[18]開發(fā)的新型核酸擴增方法。該方法成本低，可在短時間內(nèi)完成擴增，省時且無需大型專業(yè)設(shè)備，只需一臺溫控設(shè)備，是繼PCR法后倍受青睞的檢測技術(shù)。劉芳等[19]以基因ETA為靶基因，針對銅綠假單胞菌6個區(qū)域設(shè)計引物，建立水中銅綠假單胞菌的LAMP法，發(fā)現(xiàn)該法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢驗結(jié)果一致，但檢驗時間只需2h，并且可通過目測反應(yīng)體系濁度變化或顯色反應(yīng)對結(jié)果進行判斷。曹科峰等[20]以gbca基因為模板，采用電腦在線設(shè)計引物，利用反應(yīng)體系的顏色變化及瓊脂糖凝膠電泳的差異，建立了銅綠假單胞菌的LAMP檢測法，與PCR法相比，檢測靈敏度提高了約9倍。

4 結(jié)語

桶裝水銅綠假單菌污染問題與人們的生命健康息息相關(guān)，對其控制須從水源保護、加強生產(chǎn)流通各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制做起。監(jiān)管部門應(yīng)加大對桶裝水的抽檢力度，尤其是夏秋季節(jié)，要采用科學(xué)準確的方法進行檢驗，及時發(fā)現(xiàn)微生物污染情況，保證消費者的飲水安全。