氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯檢測方法研究進展

李荷麗 羅季陽 苗 虹 吳永寧 李 立

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100176；2.國家食品安全風(fēng)險評估中心）

1 前言

氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯是近年來發(fā)現(xiàn)的在食品中廣泛存在的一類污染物，它們引起的健康風(fēng)險不容忽視。氯丙醇可以分為以下4種：3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP），前2種屬于單氯取代的化合物，后2種屬于雙氯取代的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)詳見圖1。氯丙醇類物質(zhì)常溫下為液體，一般溶于水、苯、甘油乙醇、丙酮、四氯化碳、乙醚或互溶。用鹽酸水解工藝生產(chǎn)的水解植物蛋白（HVP）中往往會形成3-氯-1,2-丙二醇和1,3-二氯-2-丙醇。3-MCPD可以作為二氯丙醇（1,3-DCP和2,3-DCP）的前體，在3-MCPD濃度達到一定數(shù)值時，會進一步形成1,3-DCP和2,3-DCP，故而檢測出3-MCPD含量高的食品中常有可能伴有1,3-DCP和2,3-DCP。

圖1 氯丙醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)

氯丙醇脂肪酸酯（即氯丙醇酯）是氯丙醇類物質(zhì)與脂肪酸進行酯化反應(yīng)所形成的化合物，其種類較多。根據(jù)氯原子位置的不同，氯丙醇酯可以分為單氯取代的氯丙醇酯（MCPD酯）和雙氯取代的氯丙醇酯（DCP酯）。單氯丙醇脂肪酸酯（MCPD酯）中的羥基與脂肪酸縮合時個數(shù)不同，MCPD酯又分為MCPD單酯和MCPD雙酯。由于結(jié)構(gòu)的特殊性，3-MCPD單酯可進一步形成 SN1和 SN2 2種取代類型。氯丙醇酯理論上又可以分為7類化合物，包括單氯丙醇酯（包括單氯丙醇單酯3種和單氯丙醇雙酯2種）及2種雙氯丙醇酯。其結(jié)構(gòu)與分類詳見圖2。

圖2 氯丙醇酯的結(jié)構(gòu)與分類

氯丙醇酯的生成與油脂的精煉過程直接相關(guān)。文獻表明，3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-MCPD酯）是目前食品中污染水平較高的氯丙醇酯。如3-MCPD酯在含有可食用油和鹽的加工食品中含量較高，因為精煉植物油是3-MCPD酯的主要來源，如餅干、油脂、小吃和糕點。2-MCPD酯的污染水平相對來說比3-MCPD酯低。目前，關(guān)于1,3-DCP酯和2,3-DCP酯檢測方法及污染水平的報道相對較少。

鑒于以上基本情況，系統(tǒng)地梳理食品中的氯丙醇和氯丙醇酯靈敏、便捷、準(zhǔn)確、高效的分析檢測方法具有重要意義。本文主要從國外通用的檢測方法、國標(biāo)檢測方法和其他檢測技術(shù)3個方面系統(tǒng)地介紹氯丙醇和氯丙醇酯的檢測技術(shù)進展。

2 國內(nèi)外氯丙醇的檢測技術(shù)

氯丙醇類物質(zhì)的檢測多采用氣相色譜-質(zhì)譜法，但因氯丙醇的極性較大，沸點較高，相對分子質(zhì)量較小，故需進行衍生后生成揮發(fā)性高的物質(zhì)以提高其檢測的靈敏度。

2.1 美國官方分析化學(xué)師協(xié)會（AOAC）方法

AOAC認可的氯丙醇檢測方法，源于英國中央實驗室制定的3-MCPD氘代穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）的檢測方法，獲得國際公認，被世界各國普遍采用。此方法在試樣中加入3-MCPD-d5內(nèi)標(biāo)溶液，以硅藻土（ExtrelutTM20）為吸附劑，正己烷與乙醚混合溶劑（體積比為9∶1）為洗脫劑，HFBI作衍生化試劑，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進行定量分析，檢測限為0.005 mg/kg。AOAC的方法適用于水解植物蛋白、湯、原料、醬油、麥芽提取物、香腸、魚、奶酪、面粉、淀粉、谷物和面包中3-MCPD的測定。

2.2 中國國家標(biāo)準(zhǔn)方法

2017年6月23日開始實施的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》[1]代替了 GB/T 5009.191—2006《食品中氯丙醇含量的測定》、GB/T 18782—2002《調(diào)味品中 3-氯-1,2-丙二醇的測定》、SN/T 0548.1—2002《出口醬油中1,3-二氯-2-丙醇和2,3-二氯-1-丙醇的檢驗方法》。與舊法相比，新的標(biāo)準(zhǔn)第一法優(yōu)化了樣品前處理的步驟，具有較低的檢測限和定量限；第二法增加D5-2-MCPD、D5-2,3-DCP作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，將凈化步驟由手填的硅藻土層析柱凈化改為硅藻土小柱凈化；并刪除了原標(biāo)準(zhǔn)的第3法。這2種方法分別適用于食品中3-氯-1,2-丙二醇含量的測定和食品中氯丙醇多組分含量的測定。

2.3 其他檢測方法

根據(jù)氯丙醇及其衍生物的性質(zhì)，一般采用氣相色譜串聯(lián)電子捕獲檢測器（ECD）或氫火焰離子化檢測器（FID）進行檢測。采用ECD測定時，一般用苯基硼酸、HFBI或三氟乙酸酐（Trifluoroacetic Anhydride，TFAA）進行氯丙醇的衍生。由于HFBI衍生物的電負性較強、檢測時靈敏度較高，因此，ECD檢測更常用。Van Bergen等[2]曾報道GC-EC的檢測方法，氯丙醇的檢測限為0.05～0.1 mg/kg。

毛細管電泳法等方法也有報道。刑曉平等[3]運用毛細管電泳法測定水解植物蛋白液中3-MCPD的檢測限為0.22 mg/L。申中蘭等[4]建立了快速高效的醬油中3-MCPD的固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定方法，方法檢出限為0.005 mg/kg。易青等[5]建立了在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Online GPC-GC-MS/MS）測定方法，目標(biāo)化合物包括3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP。樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)過凈化除雜萃取，萃取液經(jīng)濃縮后測定。此種方法并未進行衍生化，前處理過程相對簡單。4種氯丙醇的檢出限范圍為0.002～0.005mg/kg，定量限為0.005～0.01 mg/kg。

3 國內(nèi)外氯丙醇酯的檢測技術(shù)

目前，氯丙醇酯檢測主要有直接測定法和間接測定法2種。

間接法采用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法，原理是首先將樣品中目標(biāo)化合物在酸、堿或酶作用下水解轉(zhuǎn)化為游離的氯丙醇，然后對氯丙醇進行衍生測定。此法測定的是氯丙醇酯的總含量，不能對氯丙醇酯單體的含量及種類進行表征。常用的衍生化試劑有酮類、硼酸類、三氟乙酸酐和七氟丁酰類等。其中，又以七氟丁酰化試劑（HFBI、HFBA）和硼酸類（苯基硼酸，Phenylboronic Acid，PBA或丁基硼酸，Butylboronic Acid，BBA）為最常用的衍生化試劑。七氟丁酰化試劑能同時與3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP發(fā)生衍生化反應(yīng)，所以能同時測定樣品中所有種類的氯丙醇酯。PBA只能衍生3-MCPD和2-MCPD，因而只能測定3-MCPD酯和2-MCPD酯，不能對1,3-DCP酯和2,3-DCP酯的實際污染狀況進行監(jiān)測。

而直接測定法則是直接測定一種或幾種不同的氯丙醇酯，不需要進行衍生反應(yīng)，大多采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）進行測定。因此，LC-MS的測定方法又可以稱作直接測定法。受市場上流通標(biāo)準(zhǔn)品種類的影響，直接測定法只能測定某個或某幾種氯丙醇酯，容易低估樣品中氯丙醇酯的含量。

3.1 德國脂肪科學(xué)學(xué)會（DGF）和美國油脂化學(xué)學(xué)會（AOCS）方法

目前，大多數(shù)文獻報道的檢測方法均源自德國脂肪科學(xué)學(xué)會（DGF）油脂中氯丙醇酯測定的標(biāo)準(zhǔn)方法C-III 18（09）和（DGF）C-VI 18（10）。C-III 18（09）這一方法首先將樣品中縮水甘油酯去除，然后將目標(biāo)化合物水解除雜，之后衍生，最后進行測定。研究表明，在特定條件下酯鍵斷裂過程中3-MCPD和縮水甘油可以相互轉(zhuǎn)化。另外，此方法在采用PBA衍生后，GC-MS檢測時靈敏度受到很大影響，故此法檢測的特異性不強，不能準(zhǔn)確地表征食品中氯丙醇酯的實際含量。 后續(xù)改進的（DGF）C-VI 18（10）測定氯丙醇酯的標(biāo)準(zhǔn)方法中，將氯丙醇酯在堿性條件下進行水解，生成氯丙醇，之后將氯丙醇與衍生劑PBA反應(yīng)，再進行GC-MS檢測，使測定結(jié)果偏大的問題得以改善。近年來，GC-MS的檢測方法在前處理技術(shù)上也有所改進和發(fā)展。氯丙醇酯常見間接測定方法詳見表1。

表1 氯丙醇酯的間接測定方法

美國油脂化學(xué)學(xué)會（AOCS）目前報道了3種測定氯丙醇酯的方法。Pinkston等[14]對植物油樣品直接稀釋并進樣，用在電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI）模式下采用LC-MS/MS方法，測定了5種3-MCPD單酯和9種3-MCPD二酯，定量限分別為0.02～0.05 mg/kg、0.05～0.1 mg/kg，個別二酯類定量限較高，達到 0.5～1 mg/kg。 MacMahon等[15]建立了可食用油中的22種3-MCPD二酯的測定方法，樣品采用硅膠柱進行凈化后，采用大氣壓化學(xué)電離（APCI）源正離子模式，LC-MS/MS方法進行測定。Dubois等[16]建立了可食用油中的7種3-MCPD單酯和7種3-MCPD二酯的LC-TOFMS的測定方法，3-MCPD單酯采用固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）、C18 和硅膠柱的凈化，3-MCPD二酯采用SPE和硅膠柱凈化。Yamazaki K.等[17]采用LC-MS/MS直接測定了油脂中10類3-MCPD酯的含量，檢出限為0.02～0.08 mg/kg。與氣相色譜或氣相質(zhì)譜法不同，液相質(zhì)譜法測定樣品前處理過程簡單，不需進行衍生化反應(yīng)。但同時這種方法也有缺點，如前文所述，以液相質(zhì)譜法所測定的只是某些氯丙醇酯含量，不能測得其總含量。鑒于此，以液相質(zhì)譜法所測得的含量不適合進行食品中氯丙醇酯膳食暴露風(fēng)險評估，但可用于氯丙醇酯的毒理學(xué)研究以及評價油脂質(zhì)量。

3.2 中國國家標(biāo)準(zhǔn)方法

2017年6月23日開始實施的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》第三法改為“食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法”，適用于食品中4種氯丙醇酯含量的測定，檢出限為0.005～0.01mg/kg，定量限的范圍為0.01～0.025 mg/kg，彌補了之前國家標(biāo)準(zhǔn)方法中沒有氯丙醇酯檢測方法的空白。

3.3 其他方法

隨著近年來檢測設(shè)備的普及，目前多采用氣相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)進行氯丙醇酯的檢測，基本未見GC法檢測技術(shù)的報道。除了李荷麗等[18]建立了穩(wěn)定性同位素稀釋的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）測定動物組織與生物體液中氯丙醇脂肪酸酯的方法之外，目前基于LC-MS技術(shù)的檢測方法，樣品基質(zhì)幾乎全部是植物油樣品。使用液相色譜-飛行時間質(zhì)量分析儀（LC-TOFMS）或高分辨Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀測定植物油中3-MCPD酯的直接檢測方法也已有報道。前處理方法中MCPD單酯和二酯的分離也還僅僅限于使用制備的硅膠柱。與植物油樣品“直接稀釋和注入儀器”的方法”[19]相比，使用硅膠柱和C18固相萃取SPE柱凈化分析3-MCPD單酯和二酯[20]能獲得更低的基質(zhì)干擾和檢出限（LOD）。對單酯和二酯單獨分析可以詳細地提供單個酯類的信息，這對于了解不同MCPD酯的污染狀況具有重要的意義。

氯丙醇酯易受到酸堿度、鹽和添加物等因素的影響，故在液相色譜條件下離子化程度一般不高。鈉離子的存在有利于化合物的電離，提高化合物的響應(yīng)值，但很容易造成離子源和質(zhì)譜儀的污染，對儀器設(shè)備的損害程度較高，需要頻繁進行清洗。再者，氯丙醇酯種類繁多，在目前的液相色譜條件下的可能不能實現(xiàn)包括同分異構(gòu)體（如SN1-3-MCPD-棕櫚酸單酯、SN2-3-MCPD-棕櫚酸單酯、2-MCPD-棕櫚酸單酯等）在內(nèi)的全部氯丙醇酯的分離，這也成為限制氯丙醇酯液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法發(fā)展的因素。目前，除了MacMahon報道分離了2對3-MCPD 單酯和2-MCPD單酯的同分異構(gòu)體和3對3-MCPD二酯和2-MCPD二酯的同分異構(gòu)體和李荷麗等報道分離了2對3-MCPD二酯和2-MCPD二酯的同分異構(gòu)體外，其他直接測定3-MCPD酯的方法均未實現(xiàn)3-MCPD酯和2-MCPD酯的分離。

4 結(jié)語

目前，中國食品中氯丙醇的檢測方法研究較多，但氯丙醇酯特別是雙氯取代的氯丙醇酯檢測方法的研究還處于空白階段，并且食品加工過程中對每個環(huán)節(jié)所產(chǎn)生氯丙醇及其酯類的快速監(jiān)測手段還很有限。因此，開展食品中氯丙醇酯檢測方法的探索研究，可為以后研究氯丙醇酯的形成機制、代謝途徑、毒理學(xué)性質(zhì)及企業(yè)改進加工工藝和條件等控制措施方面提供技術(shù)支持。