酶聯(lián)免疫法檢測(cè)艾滋病抗體的質(zhì)量控制研究

周 敏 林 哲 王甲芳 劉 萍

（濟(jì)南市歷下區(qū)疾病預(yù)防控制中心 山東濟(jì)南 250013）

1 前言

艾滋病是一種危害性極大的傳染病，若不及時(shí)防治可造成感染者不斷增加，威脅人類生命安全。而要防治艾滋病，就需要盡早對(duì)高危人群進(jìn)行艾滋病抗體檢測(cè)，以明確其抗體陽(yáng)性和陰性，指導(dǎo)臨床采取相應(yīng)的方案對(duì)其進(jìn)行治療和處理。酶聯(lián)免疫法是目前臨床檢測(cè)艾滋病抗體最常用和最有效的方法之一，其雖具有快速有效的初篩效果，但在實(shí)際檢測(cè)過程中，受人為因素、環(huán)境因素、試劑因素、儀器因素、內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清及外部對(duì)照質(zhì)控血清多方面因素影響，檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定偏差。對(duì)此，需要積極探尋有效對(duì)策，以做好酶聯(lián)免疫法檢測(cè)艾滋病抗體的質(zhì)量控制工作[1]。

2 人為因素

2.1 人員素質(zhì)

酶聯(lián)免疫法包含多種檢測(cè)方法，不同檢測(cè)方法的原理不盡相同，要完成這些試驗(yàn)檢測(cè)，不僅要求檢測(cè)人員具備豐富的免疫血清學(xué)相關(guān)理論知識(shí)和掌握各種酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)原理，同時(shí)還需熟練掌握檢測(cè)儀器的性能及操作方法、檢測(cè)試劑的性能和各種酶聯(lián)免疫法檢測(cè)步驟等，但是，在實(shí)際檢測(cè)過程中，往往有不少檢測(cè)人員自身專業(yè)技能或?qū)ψ陨硪笥写岣?，?duì)酶聯(lián)免疫法試驗(yàn)原理理解不透徹、操作過程不嚴(yán)謹(jǐn)，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生不良影響，進(jìn)而降低對(duì)艾滋病抗體檢測(cè)的質(zhì)量[2]。對(duì)此，實(shí)驗(yàn)室管理人員需要不斷強(qiáng)化檢測(cè)人員的專業(yè)技能和綜合素質(zhì)培訓(xùn)，促進(jìn)其能規(guī)范按照酶聯(lián)免疫法檢測(cè)流程開展艾滋病抗體檢測(cè)和處理有關(guān)數(shù)據(jù)，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 試劑使用

酶聯(lián)免疫法對(duì)試劑盒的特異性和敏感性要求均較高，為減少酶失活，應(yīng)避免反復(fù)凍融，也不可混用各種酶標(biāo)試劑，試劑開封后，應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用完畢。但在實(shí)際使用過程中，不少檢測(cè)人員并未按上述要求使用試劑。對(duì)此，為提高酶聯(lián)免疫法對(duì)艾滋病抗體的檢測(cè)質(zhì)量，檢測(cè)人員在使用試劑前必須進(jìn)行室溫平衡，并確保在試劑的有效期內(nèi)使用。另外，還需注意觀察試劑稀釋液中是否出現(xiàn)結(jié)晶[3]。

2.3 樣品

在檢測(cè)過程中，若檢測(cè)人員對(duì)患者血樣采集和保存控制不當(dāng)，易導(dǎo)致血樣發(fā)生污染和溶血等現(xiàn)象，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，如標(biāo)本溶血時(shí)可釋放大量過氧化物酶陽(yáng)性物質(zhì)，從而使非特異性顯色增加，對(duì)測(cè)定結(jié)果造成一定的干擾。另外，對(duì)于一些無法立刻進(jìn)行檢驗(yàn)的樣品，檢測(cè)人員往往會(huì)對(duì)其行冷凍保存。在冷凍保存后，未待標(biāo)本完全融化便對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，也會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。對(duì)此，就需要檢測(cè)人員加強(qiáng)樣品采樣期間的質(zhì)量控制，如采用帶蓋的真空管采集血樣標(biāo)本，以避免樣品發(fā)生污染和溶血，若取樣后，無法當(dāng)天對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，需將其置于2～8℃冰箱保存，保存時(shí)間最長(zhǎng)不得超過一周，對(duì)冷凍樣品進(jìn)行檢驗(yàn)前，須待其完全融化并充分搖勻后才可使用[4]。

2.4 加樣

加樣是采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)艾滋病抗體過程中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，原因在于樣品的微量變化便會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生直接影響，且其涉及多次加樣，每一項(xiàng)環(huán)節(jié)出錯(cuò)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。而在實(shí)際檢測(cè)過程中，有不少檢測(cè)人員因自身專業(yè)技能不足或工作疏忽，往往違背規(guī)范步驟進(jìn)行加樣。對(duì)此，需要檢測(cè)人員按酶聯(lián)免疫法加樣步驟進(jìn)行加樣，分別設(shè)待測(cè)樣品孔和空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）以及陰陽(yáng)性對(duì)照孔和外部對(duì)照質(zhì)控血清孔。加樣時(shí)，需將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，且保證加樣器的吸頭不觸及包被孔的內(nèi)底部，以免將包被物劃掉，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。

3 環(huán)境因素

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的溫度變化會(huì)對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)過程和結(jié)果造成較大的影響，尤其是試劑的室溫平衡、各種酶促反應(yīng)溫度條件及酶標(biāo)板周圍的溫度等會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生直接影響，但在實(shí)際檢測(cè)過程中，不少檢測(cè)人員并未意識(shí)到環(huán)境因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，未能合理控制各項(xiàng)環(huán)境因素。對(duì)此，為提高酶聯(lián)免疫法對(duì)艾滋病抗體的檢測(cè)質(zhì)量，就需要檢測(cè)人員在檢測(cè)過程中及時(shí)關(guān)閉儀器倉(cāng)門，將實(shí)驗(yàn)室溫度控制在18～25℃，并將全自動(dòng)酶免儀的溫度設(shè)定為37℃，恒定溫度條件下進(jìn)行各種酶促反應(yīng)。另外，還需保證酶標(biāo)板周圍的溫度與內(nèi)部孔一致，才能提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。

4 試劑因素

酶聯(lián)免疫法對(duì)試劑的特異性和敏感性要求均較高，排除檢測(cè)人員自身因素造成的試劑使用不當(dāng)因素，試劑本身質(zhì)量的好壞也會(huì)對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)質(zhì)量造成直接影響。在實(shí)際檢測(cè)過程中，檢測(cè)人員往往會(huì)忽視對(duì)酶聯(lián)免疫試劑質(zhì)量的篩查，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)此，就需要檢測(cè)人員在使用試劑前對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格檢驗(yàn)，確保使用的試劑符合衛(wèi)生部注冊(cè)、藥品檢定所檢定及批檢合格標(biāo)準(zhǔn)或使用經(jīng)過國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)鑒定有防偽標(biāo)志的酶免疫（EIA）檢測(cè)試劑盒。另外，還需仔細(xì)查看試劑的有效期，確保其在有效期內(nèi)使用，不可使用過期試劑[7]。

5 儀器因素

5.1 移液器

酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)加樣量較少，通常需要采用移液器進(jìn)行加樣，若移液器精度不足，將會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生直接影響。這就需要檢測(cè)人員使用移液器前校準(zhǔn)其計(jì)量，但在實(shí)際檢測(cè)過程中，檢測(cè)人員往往未進(jìn)行該步操作，從而導(dǎo)致艾滋病抗體檢測(cè)質(zhì)量不佳。對(duì)此，就需要提高檢測(cè)人員對(duì)校準(zhǔn)移液器計(jì)量精度重要性和相關(guān)校準(zhǔn)方法的認(rèn)識(shí)及掌握。

5.2 水浴箱

水浴箱溫度的高低也會(huì)對(duì)酶聯(lián)免疫試劑和樣品的反應(yīng)產(chǎn)生直接影響，雖然大部分水浴箱均配備了溫度計(jì)，但不少研究均證實(shí)，水浴箱溫度計(jì)所指示的溫度與箱內(nèi)的溫度存在一定的誤差。對(duì)此，就需要檢測(cè)人員在水浴箱內(nèi)放置溫度計(jì)，明確水浴箱溫度計(jì)所指示的溫度與箱內(nèi)實(shí)測(cè)溫度是否一致，一般允許二者之間存在±1℃的誤差，若超過這個(gè)誤差范圍，就需及時(shí)校準(zhǔn)水浴箱溫度計(jì)計(jì)量，并且還需注意觀察水浴箱蓋的密閉性。

5.3 洗板機(jī)

洗板機(jī)工作性能的好壞也會(huì)對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)艾滋病抗體的質(zhì)量造成影響，若洗板機(jī)不能順暢地流出洗液，則提示其可能發(fā)生堵塞現(xiàn)象，從而會(huì)對(duì)檢測(cè)的吸光度值造成不良影響。對(duì)此，就需要檢測(cè)人員在使用洗板機(jī)之前，對(duì)其各項(xiàng)使用性能或功能進(jìn)行調(diào)試，包含洗板機(jī)的針頭放水高度、吸水高度、加液量、泵的壓力、洗滌次數(shù)、浸泡時(shí)間及檢測(cè)試劑對(duì)洗板機(jī)的其他要求等，同時(shí)還需觀察洗板機(jī)洗板管道的氣泡及針頭的通暢情況，最好進(jìn)行預(yù)洗，以免其發(fā)生堵塞現(xiàn)象，且洗滌時(shí)各孔均需加滿洗液，以免洗滌不充分而引發(fā)非特異反應(yīng)，從而造成花板或假陽(yáng)性，進(jìn)而干擾檢測(cè)結(jié)果。使用洗板機(jī)后，需及時(shí)切斷電源并做好洗板機(jī)的維護(hù)工作，如清洗洗板針孔等，這樣才能保證其檢測(cè)質(zhì)量。

5.4 酶標(biāo)儀

酶標(biāo)儀是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)專用儀器之一，主要采用比色法進(jìn)行測(cè)定分析，檢測(cè)對(duì)象均為體積在250 μL以下的測(cè)試液，因此，該儀器對(duì)自身計(jì)量精度也有較高的要求，若其精度發(fā)生輕微偏差，便會(huì)影響整個(gè)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)此，就需要定期對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行校準(zhǔn)。另外，檢測(cè)人員還需加強(qiáng)對(duì)酶標(biāo)儀濾光片的維護(hù)，避免其發(fā)霉而影響測(cè)定結(jié)果。

6 內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清

內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清指的是試劑盒內(nèi)部廠方提供的一套陰陽(yáng)性對(duì)照血清和空白對(duì)照，若檢測(cè)人員不能按廠方提供的內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清規(guī)范進(jìn)行試驗(yàn)檢測(cè)，將會(huì)降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)此，就需要檢測(cè)人員嚴(yán)格按照試劑盒說明書中要求設(shè)立的陰陽(yáng)性對(duì)照血清和空白對(duì)照作為內(nèi)部質(zhì)控，且只能在該批號(hào)生產(chǎn)的試劑盒中使用內(nèi)部對(duì)照。

7 外部對(duì)照質(zhì)控血清

外部對(duì)照質(zhì)控血清則是實(shí)驗(yàn)室為監(jiān)控檢驗(yàn)試劑盒批間差異及每次檢測(cè)穩(wěn)定性、重復(fù)性而設(shè)置的一套陽(yáng)性和陰性血清。設(shè)置外部對(duì)照質(zhì)控血清能直觀體現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的正確性和準(zhǔn)確性。

7.1 外部對(duì)照質(zhì)控血清的使用

采用酶聯(lián)免疫法對(duì)艾滋病抗體進(jìn)行檢測(cè)的過程中，為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測(cè)人員首先需選擇弱陽(yáng)性的質(zhì)控血清開展實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照，并且，還需保證弱陽(yáng)性質(zhì)控血清的光密度（OD）值為試劑盒被測(cè)分析物量值的2～3倍；其次，對(duì)質(zhì)控血清標(biāo)定后，需采用小瓶對(duì)其進(jìn)行分裝，分裝過程中需嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)范，每一小瓶分裝需保證在1周內(nèi)使用完畢，其余不用的質(zhì)控血清置于低溫冰箱中保存。若冰凍的質(zhì)控血清融化，則不可對(duì)其進(jìn)行再次凍存，而是要將其存放于2～8℃低溫環(huán)境中保存，并在1周內(nèi)使用完畢。

7.2 質(zhì)控圖的制作

為直觀地體現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的正確性和準(zhǔn)確性，還需根據(jù)連續(xù)檢測(cè)20次外部質(zhì)控血清所得到的光度值，對(duì)其平均值、變異系數(shù)CV及標(biāo)準(zhǔn)差S進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)對(duì)外部質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果的均值和標(biāo)準(zhǔn)差來確定控制線，進(jìn)而繪制質(zhì)控圖。從第21次起，還需在質(zhì)控框架圖中點(diǎn)入每次檢測(cè)得到的質(zhì)控血清的光度值，以檢驗(yàn)其是否進(jìn)入質(zhì)控狀態(tài)。為促進(jìn)整個(gè)質(zhì)控結(jié)果更加清晰，在制作外部血清質(zhì)控圖的過程中，檢測(cè)人員還可在質(zhì)控圖中描繪試劑盒內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清的光度值，若外部質(zhì)控血清、試劑廠家及試劑批號(hào)等發(fā)生改變，還需重新制作新的質(zhì)控框架圖。

7.3 質(zhì)控圖的使用

根據(jù)制作的質(zhì)控圖，檢測(cè)人員還需對(duì)酶聯(lián)免疫法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行綜合分析：（1）告警：當(dāng)外部質(zhì)控品的光度值超出x+2s范圍時(shí)，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)，應(yīng)該引起注意；（2）失控：當(dāng)外部質(zhì)控品的光度值超出x+3s范圍時(shí)，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)；（3）漂移：連續(xù)幾次（3～5次）外部質(zhì)控品的光度值都落在均值的一側(cè)則稱為漂移，提示實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生了較大的變化。總之，出現(xiàn)一次超出3 s范圍的變化、連續(xù)2次出現(xiàn)同一方向超出2 s范圍的變化、連續(xù)4次出現(xiàn)同一方向的超出1 s范圍的變化、連續(xù)10次結(jié)果都在1 s范圍內(nèi)，但落在均值線的同一側(cè)等情況時(shí)，應(yīng)暫停檢測(cè)查找原因。此時(shí)，必須找出問題發(fā)生的原因，提出解決方法，并消除原因，避免將來出現(xiàn)同樣的問題。

8 結(jié)語(yǔ)

近年來，世界范圍內(nèi)艾滋病流行形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，新發(fā)感染數(shù)量不斷增多，這就需要艾滋病抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)艾滋病抗體的檢測(cè)，以指導(dǎo)臨床盡早采取有效方案對(duì)感染患者進(jìn)行治療和處理，從而預(yù)防和降低艾滋病的發(fā)生。酶聯(lián)免疫法具有自動(dòng)化強(qiáng)度高、檢測(cè)速度快、有利于大規(guī)模篩檢等眾多優(yōu)勢(shì)，但是，在實(shí)際檢測(cè)過程中，受多方面因素的影響，常易影響檢測(cè)質(zhì)量。對(duì)此，就需要檢測(cè)人員不斷提高自身專業(yè)技能和素質(zhì)，規(guī)范做好儀器使用前的校準(zhǔn)，嚴(yán)格控制使用試劑質(zhì)量、試驗(yàn)溫度及內(nèi)外部質(zhì)控血清等，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。