耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌中OXA-48 家族碳青霉烯酶分子流行病學(xué)研究進(jìn)展

韓仁如，胡付品

作者單位： 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，國家衛(wèi)健委臨床藥理重點實驗室，上海 200040。

1 引言

碳青霉烯類抗生素對超廣譜β 內(nèi)酰胺酶（ESBL）和頭孢菌素酶具有高度的穩(wěn)定性，但可被碳青霉烯酶水解、滅活，隨著臨床治療藥物的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了耐碳青霉烯類的菌株，這給臨床抗感染治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。近年來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）的比率增加，特別是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）比率增加。根據(jù)2017年CHINET數(shù)據(jù)顯示，2005－2017年，肺炎克雷伯菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別從2.9%和3.0%上升到了24.0%和20.9%，耐藥率上升幅度高達(dá)8倍[2]。CRE的激增主要是由碳青霉烯酶基因出現(xiàn)和播散引起[3]。

臨床上常見碳青霉烯類抗生素主要有美羅培南、亞胺培南、厄他培南和多利培南等。腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制是：①產(chǎn)碳青霉烯酶；②產(chǎn)ESBL或頭孢菌素酶合并外膜蛋白的缺失或變異；③碳青霉烯類抗生素的作用靶位發(fā)生改變。其中產(chǎn)碳青霉烯酶是最常見的耐藥機(jī)制[4]。臨床常見的碳青霉烯酶包括Ambler A類絲氨酸水解酶（如KPC、GES）、Ambler B類金屬酶（如NDM、IMP、VIM、SIM、GIM）和Ambler D類絲氨酸水解酶（如OXA-48、OXA-23、OXA-51等）。與其他OXA家族強(qiáng)水解碳青霉烯類作用的苯唑西林酶不同，OXA-48型β內(nèi)酰胺酶具有較弱的水解碳青霉烯類作用[5]，并且該酶及其變體目前廣泛存在于肺炎克雷伯菌和其他腸桿菌科細(xì)菌中[6]。

2 流行病學(xué)特征

2001年，從土耳其伊斯坦布爾的1例泌尿系統(tǒng)和皮膚燒傷感染的54歲男性患者中分離出1株CRKP 11978，發(fā)現(xiàn)并鑒定出一種新型的具有水解碳青霉烯類作用的β內(nèi)酰胺酶OXA-48[7]。隨后，在世界范圍內(nèi)相繼報道，是社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染暴發(fā)的主要來源之一，主要集中在中東和歐洲等地區(qū)，其他國家也有報道，如中國、美國、印度等[6]。土耳其仍然是D類酶檢出率最高的國家，在最近的一項研究中，土耳其檢出的CRE菌株中92%是產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶菌株[8]。根據(jù)EuSCAPE工作組的報告，2014－2015年在西班牙、法國、比利時和羅馬尼亞OXA-48的流行水平達(dá)到第4階段或 “區(qū)域間傳播”（在不同的衛(wèi)生區(qū)域發(fā)生多次流行病學(xué)相關(guān)的暴發(fā)，這表明區(qū)域間的暴發(fā)在本土機(jī)構(gòu)間傳播）[9]。迄今為止，已經(jīng)鑒定出11種OXA-48型碳青霉烯酶的變體（如OXA-232、OXA-181、OXA-162、OXA-163等），廣泛存在于肺炎克雷伯菌和其他腸桿菌科細(xì)菌中[6]，并且具有顯著的地域差異。2015年，四川大學(xué)華西醫(yī)院首次從1例血流感染患者中分離出1株產(chǎn)OXA-181型碳青霉烯酶的大腸埃希菌[10]，隨后2017年復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院在新生兒中分離出產(chǎn)OXA-232型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[11]，我國主要流行這兩種OXA-48型碳青霉烯酶的變體。編碼OXA-48家族碳青霉烯酶的基因通常位于單個質(zhì)粒上，可在不同菌屬的腸桿菌科細(xì)菌中傳播[12]，并且能夠合并其他耐藥基因，表現(xiàn)出多重耐藥的特 性。

3 分子生物學(xué)特性

OXA-48型碳青霉烯酶屬于Ambler D類酶，Bush分類Ⅳ型，是質(zhì)粒介導(dǎo)一般不被克拉維酸抑制的β內(nèi)酰胺酶，對青霉素具有強(qiáng)水解活性，弱水解或不水解頭孢菌素酶[13]。泛宿主性質(zhì)粒攜帶blaOXA-48位于復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn19992內(nèi)，pOXA-48a（OXA-48a型質(zhì)粒）序列分析表明，blaOXA-48上下游分別有一段插入序列IS19992，blaOXA-48上游有編碼噬菌體復(fù)制蛋白的rep基因，下游有編碼調(diào)節(jié)蛋白的lysR基因以及一個編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因片段[12]。blaOXA-48最常見于IncL/M質(zhì)粒中，該質(zhì)粒大小為60～70 kb，無其他耐藥基因，是腸桿菌科中常見的質(zhì)粒之一，通常存在于環(huán)境和臨床菌株中，這可能與blaOXA-48易于播散的特性相關(guān)[14-15]。此外，有研究報道，pOXA-48a中的轉(zhuǎn)移操作子與pCTX-M-3中的轉(zhuǎn)移操作子非常相似，由兩個不同的區(qū)域組成，這一共同特征表明，blaOXA-48在腸桿菌科細(xì)菌中的傳播傾向可能與blaCTX-M-3相仿[12]。

另外，Turton等[16]報道的2株大腸埃希菌分離株染色體整合了blaOXA-48，與質(zhì)粒上blaOXA-48具有相似的基因排列，其中攜帶blaOXA-48的質(zhì)粒片段由IS1R元件整合到染色體上，但質(zhì)粒片段的長度和插入位點各不相同。質(zhì)粒片段來源于pOXA-48a[17]。在另一項研究中，Beyrouthy等[6]研究發(fā)現(xiàn)OXA-48型碳青霉烯酶遺傳環(huán)境的可塑性是由IS1R插入序列介導(dǎo)的，插入序列可誘導(dǎo)OXA-48編碼基因轉(zhuǎn)入大腸埃希菌染色體，從而促進(jìn)其低水平的持續(xù)表達(dá)。

4 耐藥機(jī)制

4.1 OXA-48型碳青霉烯酶

越來越多的腸桿菌科細(xì)菌中出現(xiàn)D類β內(nèi)酰胺酶OXA-48。OXA-48型碳青霉烯酶對碳青霉烯類具有弱水解活性，對亞胺培南的水解活性大于對美羅培南的活性，厄他培南則是這種酶作用的最佳底物[6]。此外，當(dāng)編碼OXA-48型酶的基因被克隆到碳青霉烯類敏感的大腸埃希菌質(zhì)控菌株中時，導(dǎo)致對碳青霉烯類的最低抑菌濃度（MIC）適度增加（MIC從0.004～0.12 mg/L增加至0.1～0.5 mg/L）[7，18-19]。當(dāng)合并膜孔蛋白缺失或變異時，OXA-48型可能表現(xiàn)出對碳青霉烯類的強(qiáng)水解活性，導(dǎo)致其對厄他培南耐藥，對美羅培南敏感性降低，對亞胺培南敏感[20]。

4.2 OXA-48型碳青霉烯酶的變體

到目前為止，已經(jīng)確定了11種類似OXA-48型碳青霉烯酶的變體，如OXA-162、OXA-163、OXA-204、OXA-244、OXA-245、OXA-247、OXA-370、OXA-405等通過一個氨基酸的替換或是4個氨基酸的缺失降低了其水解碳青霉烯類的能力[21]。這些酶對青霉素具有強(qiáng)水解活性，而對碳青霉烯類僅有弱水解作用，對β內(nèi)酰胺酶抑制劑不敏感，不水解廣譜頭孢菌素。OXA-163型是一個例外，可水解廣譜頭孢菌素，但水解碳青霉烯類能力非常弱，并且對β內(nèi)酰胺酶抑制劑敏感[18]。OXA-181和OXA-232與OXA-48型碳青霉烯酶水解抗菌藥物譜相似[6]。在中國的首例報道中發(fā)現(xiàn)OXA-232型碳青霉烯酶合并膜孔蛋白OmpK35和OmpK36的變異，導(dǎo)致其對碳青霉烯類的耐藥[11，20]。

4.3 產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶及其變體菌株攜帶其他耐藥基因

4.3.1 ESBL和AmpC基因 有研究表明，大多數(shù)產(chǎn)OXA-48型酶及其變體的分離株因攜帶CTX-M-15或CTX-M-14基因，同時攜帶TEM-1和/或OXA-1基因產(chǎn)生ESBL[22]。此外，其他研究也證實了產(chǎn)OXA-48型變體的腸桿菌科細(xì)菌在其他質(zhì)粒上共表達(dá)ESBL和AmpC基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M等[6]。

4.3.2 碳青霉烯酶基因 根據(jù)不同國家研究報道發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)OXA-48型及其變體的腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)同時存在其他碳青霉烯酶基因，如blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-7、blaKPC-2、blaVIM-1、blaVIM-5、blaIMP-1等[6]。

4.3.3 其他耐藥基因 根據(jù)不同國家研究報道發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)OXA-48型及其變體的腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS和氨基糖苷類耐藥基因aac(6')-Ib-cr、aac(3)-II、rmA、rmtB、rmtC和rmtF等[6]。

5 檢測方法

由于許多產(chǎn)OXA-48型腸桿菌科細(xì)菌對廣譜頭孢菌素沒有耐藥性，或者對碳青霉烯類的敏感性降低，因此對這些細(xì)菌識別和檢測可能具有挑戰(zhàn)性，需要適當(dāng)?shù)暮Y查和檢測方法來預(yù)防和控制其傳播[23]。CLSI推薦的碳青霉烯酶檢測方法，如改良Hodge試驗、改良滅活碳青霉烯試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM試驗）和Carba NP等試驗雖然能檢測出產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株，卻無法確定其表型，需要進(jìn)一步的基因檢測驗證，并且對其中一些碳青霉烯酶OXA-232型和OXA-181型的檢出率低，假陰性率高[24]。

5.1 表型檢測方法

根據(jù)OXA-48具有水解替莫西林活性高的特點，進(jìn)行相應(yīng)的藥敏試驗，結(jié)果表明，根據(jù)替莫西林MIC值能夠在產(chǎn)OXA-48酶的菌株和WT易感菌株以及攜帶ESBL/AmpC的菌株之間進(jìn)行表型區(qū)分，而與其他碳青霉烯酶的區(qū)別可能需要進(jìn)行基因檢測[25]。

免疫色譜法（immunochromatographic tests，ICT）可以快速檢測出4種最常見的碳青霉烯酶：OXA-48型、KPC型、NDM型和VIM型。具有靈敏度和特異度高、快速、易于操作等特點[26]。

5.2 分子檢測方法

FDA-cleared 試驗：BioFire FilmArray?（法國梅里埃公司）可以檢測常見的幾種KPC、VIM、IMP、NDM和OXA產(chǎn)碳青霉烯酶基因，靈敏度和特異度高，但是只能直接檢測血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的細(xì)菌種類和耐藥基因，并且成本高。BD MAX?CRE（美國BD）通過其系統(tǒng)檢測KPC、NDM和OXA-48基因的存在，該系統(tǒng)可在約2.5 h內(nèi)自動進(jìn)行樣品提取、擴(kuò)增和實時PCR檢測，具有靈敏度和特異度高的特點[27]。CepheidXpert?Carba-R（美國賽沛）是一種基于試劑盒的定性實時PCR檢測，旨在檢測KPC、NDM、VIM、IMP-1和OXA-48基因，并且在48 min內(nèi)提供結(jié)果。此外，該測定現(xiàn)在涵蓋OXA-181、OXA-232和OXA-48基因及其他變體，可直接檢測直腸拭子標(biāo)本。Check-Points B.V.（荷蘭Check-Points）提供各種檢測方法，用于檢測臨床標(biāo)本和細(xì)菌分離株中的碳青霉烯酶、ESBL和AmpC酶。Check-Direct CPE測定是一種多重實時PCR測定，其在2 h內(nèi)直接從直腸拭子或集落靶向KPC、NDM、VIM和OXA-48基因，但不靶向IMP[27]。雖然分子檢測方法可以快速檢測碳青霉烯酶基因，但作為常規(guī)篩查來說，成本高，操作繁瑣，難以廣泛應(yīng)用。

6 結(jié)束語

腸桿菌科細(xì)菌是臨床最常見的病原體，可導(dǎo)致社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染，產(chǎn)OXA-48家族碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌易于播散和多重耐藥的特性將會給公共健康帶來威脅。而碳青霉烯類抗生素作為臨床治療革蘭陰性桿菌的最后一道防線，保留碳青霉烯類藥物療效對于臨床上治療嚴(yán)重的革蘭陰性菌感染至關(guān)重要[5]。因此，早期檢測篩查定植或感染產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株具有重要意義。醫(yī)院需要加強(qiáng)院感控制，監(jiān)測耐藥細(xì)菌的發(fā)生率，積極采取措施控制耐藥細(xì)菌的傳播，以保護(hù)人類健康。