HPLC法測(cè)定癌痛消方及其拆方中松脂醇二葡萄糖苷和芍藥苷的含量

程金來 梁丹 夏猛 曹子茵 冷靜

摘要：目的? 建立癌痛消方及其拆方中松脂醇二葡萄糖苷和芍藥苷的測(cè)定方法。方法? 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（Inertsil ODS-3柱 250×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（0～16 min，松脂醇二葡萄糖苷），277 nm（16～30 min，芍藥苷）;流速：1.0 ml/min;柱溫：30oC。結(jié)果? 癌痛消-補(bǔ)虛組中松脂醇二葡萄糖苷在1.0～5.0 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9992，平均回收率為97.23%（RSD=1.31%，n=6）;癌痛消-抑癌組中芍藥苷在1.0～5.0 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9993，平均回收率為97.08%（RSD=1.38%，n=6）;癌痛消-全方中松脂醇二葡萄糖苷在1.0～5.0 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9992，平均回收率為98.01%（RSD=1.30%，n=6）;癌痛消-全方中芍藥苷在1.0～5.0μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9993，平均回收率為96.97%（RSD=1.54%，n=6）;結(jié)論? 本方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性良好，可用于癌痛消方的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：癌痛消方;含量測(cè)定;松脂醇二葡萄糖苷;芍藥苷;HPLC

中圖分類號(hào)：R286.0? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.23.020

文章編號(hào)：1006-1959（2019）23-0073-05

Determination of Rosinol Diglucoside and Paeoniflorin in Cancer Painkiller and

Its Decomposed Formula by HPLC

CHENG Jin-Lai，LIANG Dan，XIA Meng，CAO Zi-Yin，LENG Jing

（Basic Medical College of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine/Guangxi Key Laboratory of Laboratory Animal Disease Models/Guangxi Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine and Translational Medicine

for High Infectious Diseases，Nanning 530200，Guangxi，China）

Abstract：Objective? To establish a method for the determination of rosinol diglucoside and paeoniflorin in Cancer Decoction and its decomposed formula. Methods? An octadecylsilane bonded silica gel column （Inertsil ODS-3 column 250×4.6 mm， 5 μm）; mobile phase： acetonitrile-0.1% phosphoric acid （15：85） as mobile phase， gradient elution; detection wavelength： 230 nm （0～16 min， rosinol diglucoside）， 277 nm （16～30 min， paeoniflorin）; flow rate： 1.0 ml/min; column temperature： 30oC. Results? In the cancer pain-compensation group， rosinol diglucoside showed a good linear relationship in the range of 1.0～5.0 μg， r=0.9992， and the average recovery was 97.23% （RSD=1.31%， n=6）;The paeoniflorin showed a good linear relationship in the range of 1.0～5.0 μg， r=0.9993， and the average recovery was 97.08% （RSD=1.38%， n=6）. Cancer pain elimination-total rosin Diglucoside showed a good linear relationship in the range of 1.0～5.0 μg， r=0.9992， the average recovery was 98.01% （RSD=1.30%， n=6）; The cancer has a good linear relationship in the range of 1.0～5.0μg， r=0.9993， and the average recovery rate is 96.97% （RSD=1.54%， n=6）. Conclusion? This method has strong specificity. High accuracy and good reproducibility， can be used for quality control of cancer pain.

Key words：Cancer pain elimination;Determination of content;Rosinol diglucoside;Paeoniflorin; HPLC

癌痛消方是廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋艾凌博士根據(jù)肝癌的發(fā)病特點(diǎn)并結(jié)合肝癌的現(xiàn)代研究成果，在經(jīng)典方膈下逐瘀湯的基礎(chǔ)上加味而成，具有活血化瘀、清熱解毒、益氣健脾、行氣止痛的功效[1]。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科專家的指導(dǎo)后，將該方拆分成癌痛消方-補(bǔ)虛組、癌痛消方-抑癌組。本文在參考藥典[2]后，采用高效液相色譜法（HPLC法）對(duì)癌痛消方-補(bǔ)虛組中的松脂醇二葡萄糖苷、癌痛消方-抑癌組中的芍藥苷、癌痛消方-全方中的松脂醇二葡萄糖苷及芍藥苷進(jìn)行定量研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器? Agilnt1260型高效液相色譜儀;KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;GX-20型搖擺式中藥粉碎機(jī)（上海榮舒工貿(mào)有限公司）;SHB-Ⅲ循水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京高信儀器設(shè)備有限公司）;調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）;YP50001電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）;SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;RE52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;TF881 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（吳江同豐烘箱電爐有限公司）;FYL-YS-50L恒溫箱（北京福意聯(lián)電器設(shè)備有限公司）。

1.2試藥? 松脂醇對(duì)照品（批號(hào)：180423）購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：180420）購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;乙腈為色譜純;甲醇和磷酸為分析純;水為自制重蒸水;其他試劑均為分析純;癌痛消方所需中藥材購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室廖月葵教授鑒定杜仲本品為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）的干燥樹皮、赤芍為毛茛科植物芍藥 （Paeonia lactiflora Pall）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根等。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件? 色譜柱：Inertsil ODS-3柱（4.6×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，? V/V）為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫;流速：1.0 ml/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10 μl;癌痛消-補(bǔ)虛組：檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm;理論板數(shù)按松脂醇二葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。癌痛消-抑癌組：檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm;理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。癌痛消-全方：檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（0～16 min，松脂醇二葡萄糖苷），277 nm（16～30 min，芍藥苷）;理論板數(shù)按松脂醇二葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備? ①癌痛消-補(bǔ)虛組：松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液的制備：取松脂醇二葡萄? 糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l ml含0.5 mg的溶液，即得。②癌痛消-抑癌組：芍藥苷對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定后，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含芍藥苷0.5 mg的溶液，即得。③癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液的制備：取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即得;芍藥苷對(duì)照品溶液的制備：首先取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定后，置于棕色量瓶中，再加甲醇制成每1 ml含芍藥苷20 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備? ①癌痛消-補(bǔ)虛組：按處方量精密稱取4味中藥材飲片，加入10倍量的水，加熱提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。②癌痛消-抑癌組：按處方量精密稱取7味中藥材飲片，加入8倍量的80%乙醇，加熱回流提取2次，? 每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容? ?備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心10min，過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。③癌痛消-全方：按處方量精密稱取補(bǔ)虛扶正組4味中藥材飲片，加入10倍量的水，加熱回流提取2次，每次提取? ? 1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液;在藥渣中按處方量精密稱取抑癌組7味中藥材飲片，加入8倍量的80%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液。合并水提取液與80%乙醇提取液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液的制備? ①癌痛消-補(bǔ)虛組：按處方量精密稱取除杜仲以外的3味中藥材飲片，加入10倍量的水，加熱提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得。②癌痛消-抑癌組：按處方量精密稱取除芍藥以外的6味中藥材飲片，加入8倍量的80%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次? ? ?濾液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得。③癌痛消-全方：按處方量精密稱取補(bǔ)虛扶正組取除杜仲以外的3味中藥材飲片，加入10倍量的水，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液;在藥渣中按處方量精密稱取抑癌組除芍藥以外的6味中藥材飲片，加入8倍量的80%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液。合并水提取液與80%乙醇提取液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1陰性干擾試驗(yàn)? 取“2.2”項(xiàng)下3種溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，分別測(cè)定其峰面積。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖保留時(shí)間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，分離度均>1.5，并且陰性供試品無(wú)干擾峰出現(xiàn)。①癌痛消-補(bǔ)虛組：理論板數(shù)按松脂醇二葡萄糖苷峰計(jì)算均不低于1000，表明陰性樣品中其他組分對(duì)松脂醇的測(cè)定無(wú)干擾，見圖1。②癌痛消-抑癌組：理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算均不低于3000，表明陰性樣品中其他組分對(duì)芍藥苷的測(cè)定無(wú)干擾，見圖2。③癌痛消-全方：理論板數(shù)按理論板數(shù)按松脂醇二葡萄糖苷峰計(jì)算均不低于1000，表明陰性樣品中其他組分對(duì)松脂醇、芍藥苷的測(cè)定無(wú)干擾，見圖3。

2.3.2線性關(guān)系考察? 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μl進(jìn)樣測(cè)定峰面積，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，分別測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得其回歸方程。癌痛消-補(bǔ)虛組：松脂醇二葡萄糖苷回歸方程y=1269.6x+2071.4，相關(guān)系數(shù)r=0.9992;癌痛消-抑癌組：芍藥苷回歸方程y=2425.3x+264.76，相關(guān)系數(shù)r=0.9993;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷回歸方程y=1269.6x+2071.4，相關(guān)系數(shù)r=0.9992;芍藥苷回歸方程y=2425.3x+264.76，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。試驗(yàn)結(jié)果表明，松脂醇二葡萄糖苷進(jìn)樣量在1.0～5.0 μg，芍藥苷進(jìn)樣量在1.0～5.0 μg，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度考察? 精密的吸取同一對(duì)照品溶液? ? 10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其色譜峰的峰面積，計(jì)算結(jié)果。癌痛消-補(bǔ)虛組：松脂醇二葡萄糖苷 RSD為0.89%;癌痛消-抑癌組：芍藥苷RSD為0.34%;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷RSD為0.89%、芍藥苷RSD為0.34%，試驗(yàn)結(jié)果均顯示儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性考察? 按“2.2.2”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，精密吸取10 μl進(jìn)樣分析。測(cè)定癌痛消-補(bǔ)虛組：松脂醇二葡萄糖苷的含量，其RSD分別為1.30%;癌痛消-抑癌組：芍藥苷的含量，其RSD分別為0.16%;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷、芍藥苷的含量，其RSD分別為1.61%、2.54%，結(jié)果均顯示該方法重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取10 μl進(jìn)樣分析，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件。測(cè)定癌痛消-補(bǔ)虛組：松脂醇二葡萄糖苷的峰面積，其RSD為2.03%;癌痛消-抑癌組：芍藥苷的峰面積，其RSD為0.15%;癌痛消-全方：松脂醇二葡萄糖苷、芍藥苷的峰面積，其RSD分別為0.51%、0.44%。結(jié)果均顯示供試品穩(wěn)定性良好。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)? 精密量取已知松脂醇二葡萄糖苷或芍藥苷含量的供試品溶液，每個(gè)方子6份，共18份。分別加入一定量的松脂醇二葡萄糖苷或芍藥苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣的回收率，見表1。

2.4樣品含量測(cè)定? 按處方量分別精密稱取3份、3份、11份上述味藥材飲片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析后，計(jì)算松脂醇二葡萄糖苷、芍藥苷的含量，見表2。

3討論

肝癌為多發(fā)疾病，其病因是機(jī)體在內(nèi)外因素的作用下，機(jī)體氣機(jī)不暢，陰陽(yáng)失衡，臟腑虧虛，氣血不暢，機(jī)體正氣虛衰日久，痰、濁、毒、淤等病理產(chǎn)物互結(jié)，凝結(jié)日久，形成肝癌。據(jù)此，以祛邪扶正的治則，清、消、補(bǔ)三法合用，在膈下逐淤湯方的基礎(chǔ)上，加減成為癌痛消方[3]。其全方組成：黃芪30 g、杜仲20 g、黨參10 g、炙甘草10 g、莪術(shù)10 g、三棱10 g、桃仁10 g、赤芍30 g、鱉甲20 g、龜板20 g、牡蠣20 g。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科專家的指導(dǎo)后，將該方拆分成癌痛消方（補(bǔ)虛組）、癌痛消方（抑癌組）。癌痛消方（補(bǔ)虛組）組成：黃芪30 g、杜仲? 20 g、黨參10 g、炙甘草10 g;癌痛消方（抑癌組）組成：莪術(shù)10 g、三棱10 g、桃仁10 g、赤芍30 g、鱉甲20 g、龜板20 g、牡蠣20 g。

綜上所述，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC法）后，測(cè)得結(jié)果比較理想，本法專屬性強(qiáng)，操作方便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性良好，可以用于癌痛消方及其拆方的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

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[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：105.

[3]胥冰，黃峰，韋艾凌，等.癌痛消方對(duì)DEN誘癌大鼠不同時(shí)間點(diǎn)凋亡相關(guān)蛋白的影響[J].華西藥學(xué)雜志，2017，32（5）：489-492.

收稿日期：2019-9-17;修回日期：2019-9-30

編輯/肖婷婷