草魚魚鱗膠原蛋白肽及其肽-鈣螯合物 的結(jié)構(gòu)表征

張琬悅 王詩瑤 楊平 徐昕 孫子涵

【摘? ?要】 本試驗(yàn)酶解草魚魚鱗膠原蛋白制備膠原蛋白肽，并以此為原料制備肽-鈣螯合物，利用傅里葉紅外光譜分析法、紫外光譜分析法和差示掃描量熱分析法對所得膠原蛋白肽和肽-鈣螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

【關(guān)鍵詞】 草魚魚鱗;膠原蛋白肽;肽-鈣鰲合物;結(jié)構(gòu)表征

Structural characterization of collagen peptide and its peptide-calcium chelate in grass carp scales

Zhang Wanyue? ?Wang Shiyao? ?Yang Ping? ?Xu Xin? ?Sun Zihan

（Grain College Of Shenyang Normal University? ?110000）

[Abstract]? In this experiment， collagen peptide was prepared by enzymatic hydrolysis of grass carp scale collagen protein， and then used as raw material to prepare peptide-calcium chelate. The structure of collagen peptide and peptide-calcium chelate was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy， ultraviolet spectroscopy and differential scanning calorimetry.

[Keywords]? grass carp scale; collagen peptide; peptide-calcium chelate; structure characterization

近年來，膠原蛋白肽作為一種新型的功能食品配料在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。它具有多種生物功效，其中鰲合鈣的作用十分矚目。研究表明，多肽鰲合鈣比氨基酸鰲合鈣更易吸收，是更為理想的促鈣吸收制劑。本試驗(yàn)采用酶解法，以中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解草魚鱗膠原蛋白，利用中空纖維過濾組件過濾酶解液，得到分子量小于10KD的膠原蛋白肽，并以此為原料，制備肽-鈣螯合物。利用傅里葉紅外光譜分析法、紫外光譜分析法及差示熱量掃描法對所得膠原蛋白肽及肽-鈣螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1? 材料與方法

1.1? 材料

草魚魚鱗 購于沈陽市小寶生鮮水產(chǎn)店;中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，丹麥Novozymes公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 主要設(shè)備

水浴恒溫振蕩器，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;傅里葉紅外光譜儀，瑞士Bruker公司; BCD-198SIEMENS冰箱，博西華家用電器有限公司;Scientz-12N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;MicroKros中空纖維過濾組件（10KD），上海瑞普利金生物科技有限公司;差式掃描量熱儀，上海盈諾精密儀器有限公司;紫外分光光度計(jì)，濟(jì)南思泉醫(yī)療機(jī)械公司。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠原蛋白肽的制備

1.3.1.1膠原蛋白的制備? 參照文獻(xiàn)[1]的方法，制得草魚魚鱗膠原蛋白。

1.3.1.2膠原蛋白肽的制備? 將膠原蛋白配制成1mg/ml的懸濁液，加入中性蛋白酶及復(fù)合蛋白酶，調(diào)節(jié)PH至6.5，在55℃水浴恒溫振蕩器中酶解223min，反應(yīng)結(jié)束后100℃水浴鍋滅酶10min，得到初步酶解的膠原蛋白肽的溶液。待酶解液冷卻后用中空纖維過濾組件過濾酶解液?；厥找航?jīng)真空冷凍干燥得到草魚魚鱗膠原蛋白肽樣品。

1.3.2 膠原蛋白肽-鈣螯合物的制備

1.3.2.1 制備? 參照文獻(xiàn)[2]的方法，膠原蛋白肽溶液→調(diào)節(jié)螯合條件（溫度42℃、p H6.8、投入氯化鈣質(zhì)量比2：1、時(shí)間50min）→螯合→3 倍無水乙醇沉淀螯合物→離心（8 000 r/min;10 min），收集沉淀→真空冷凍干燥

1.3.2.2 膠原蛋白肽與鈣結(jié)合率的測定? 采用EDTA絡(luò)合滴定法。結(jié)果計(jì)算如下：

鰲合率/%=（m-m1）/m

螯合物中鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%=（m-m1）/（m2+m-m1） ×100%

m：鈣離子總質(zhì)量/mg

m1：游離鈣離子質(zhì)量/mg

m2：膠原蛋白肽質(zhì)量/mg

1.3.3 膠原蛋白肽及其肽-鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 差示掃描量熱分析? 稱取樣品5mg左右，用差示掃描量熱儀進(jìn)行掃描，溫度范圍50-150℃，加熱速率為10℃/min。

1.3.2.2 傅里葉紅外光譜分析? 將1mg膠原蛋白肽及肽-鈣螯合物樣品分別與溴化鉀粉末混合壓片，在400～4 000 cm-1波數(shù)區(qū)間掃描，分辨率4cm-1。

1.3.2.3 紫外光譜掃描分析? 分別將膠原蛋白肽及肽鈣螯合物樣品配制成1mg/mL的溶液。取適量該溶液在200-500nm處進(jìn)行紫外掃描。

1.3.2.4 數(shù)據(jù)分析? 試驗(yàn)數(shù)據(jù)為三組數(shù)據(jù)平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Excel2013和Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2? 結(jié)果討論

2.1? 肽鈣鰲合率測定結(jié)果

按照上述方法測定鰲合反應(yīng)液中的鈣離子質(zhì)量，由公式計(jì)算得膠原蛋白肽與鈣離子鰲合率為50.0%±0.5%。螯合物中鈣離子含量為19.7%±0.5%。

2.2? 差示掃描量熱分析測定結(jié)果

劉閃等[5]利用差示掃描量熱法測得膠原蛋白肽的熱變性溫度在78.9℃，肽-鈣螯合物則在112℃出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)吸收峰。用差示掃描量熱法測得膠原蛋白肽及肽-鈣螯合物的DSC曲線如圖1所示。膠原蛋白肽的吸收峰出現(xiàn)在73℃，說明此時(shí)膠原蛋白肽發(fā)生了熱變性。而肽-鈣螯合物的吸收峰出現(xiàn)在117℃，這可能是因?yàn)槟z原蛋白肽結(jié)合鈣離子后自然結(jié)構(gòu)被改變，產(chǎn)生的新物質(zhì)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。由此可以初步推斷膠原蛋白肽與鈣離子發(fā)生了鰲合。

2.3? 紅外光譜分析結(jié)果

膠原蛋白肽和肽-鈣螯合物的傅里葉紅外光譜如圖3所示。3400cm-1附近為-COOH中-OH的伸縮振動(dòng)區(qū)域與N-H的伸縮振動(dòng)區(qū)域重疊。膠原蛋白肽在此區(qū)域內(nèi)的吸收峰出現(xiàn)在3346 cm-1處，而肽-鈣螯合物的吸收峰藍(lán)移至3421cm-1，波峰變寬，這表明肽中氨基的伸縮振動(dòng)發(fā)生變化。膠原蛋白肽的紅外譜圖中波數(shù)位于2983 cm-1、2952 cm-1、2831 cm-1、2740 cm-1和2715 cm-1處的峰消失，此為羥基和醛基的伸縮振動(dòng)區(qū)域，原因可能是螯合反應(yīng)導(dǎo)致膠原蛋白肽內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。1633cm-1附近的吸收峰來自酰胺Ⅰ帶的-c=o伸縮振動(dòng)，肽-鈣螯合物的該峰藍(lán)至1650 cm-1。1560cm-1附近是酰胺Ⅱ帶氨基面內(nèi)變形振動(dòng)，肽-鈣螯合物的此峰紅移至1558cm-1，表明多肽的羧基和氨基均參與了鈣的配位。1400 cm-1處為羧基的特征吸收峰，肽-鈣螯合物的譜圖中此峰消失，說明羧基可能參與了鰲合反應(yīng)。1081cm-1處為氨基的吸收峰，多肽與鈣鰲合后該峰紅移至1072 cm-1處，表明多肽鏈中的氨基與鈣離子發(fā)生鰲合。

2.4? 紫外吸收掃描結(jié)果

膠原蛋白肽與肽-鈣鰲合物的紫外掃描光譜如圖3所示。膠原蛋白肽的吸收峰在波長為200～250范圍內(nèi)較強(qiáng)，這是膠原蛋白肽的殘基和肽鍵的特征吸收區(qū)域。膠原蛋白肽的吸收峰出現(xiàn)在234nm，肽-鈣螯合物的吸收峰值在225nm，吸收峰發(fā)生偏移，峰的位置向短波長移動(dòng)。這是由于膠原蛋白肽與鈣離子鰲合后，物質(zhì)中原子或者分子相互作用，發(fā)生價(jià)電子躍遷和能量級變化，最終吸收光的波長發(fā)生改變。

3? 結(jié)論

酶解草魚魚鱗膠原蛋白所得膠原蛋白肽與鈣離子鰲合，傅里葉紅外光譜分析、紫外光譜分析以及差示掃描量熱分析均可以支撐該結(jié)論。差示掃描量熱分析顯示經(jīng)過鰲合反應(yīng)后，物質(zhì)的熱變性由73℃升高到117℃，由此推斷產(chǎn)生了一種穩(wěn)定性更高的產(chǎn)物。比較膠原蛋白肽和肽-鈣螯合物的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)，N-H伸縮振動(dòng)發(fā)生了改變，同時(shí)波峰變寬;酰胺Ⅰ帶的-c=o伸縮振動(dòng)和酰胺Ⅱ帶的氨基面內(nèi)變形振動(dòng)發(fā)生了變化，同時(shí)1081cm-1處吸收峰發(fā)生了紅移，即氨基的伸縮振動(dòng)發(fā)生變化。氨基參與了螯合反應(yīng)。而膠原蛋白肽在1400 cm-1處羧基的特征吸收峰在肽-鈣螯合物的譜圖中消失，說明膠原蛋白肽中的羧基也參與了鰲合反應(yīng)。紫外光譜分析結(jié)果顯示，相比膠原蛋白肽的吸收峰，肽-鈣螯合物的最大吸收峰向短波長處移動(dòng)，說明物質(zhì)吸收光的性能改變，即鰲合鈣使物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

綜合以上結(jié)果，草魚魚鱗膠原蛋白肽與鈣結(jié)合，生成了肽-鈣鰲合物。

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