鮑曼不動桿菌異質(zhì)性耐藥研究進展

方 云，王 起，柏長青，李璞媛

(1. 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心呼吸與危重癥醫(yī)學科，北京 100071； 2. 航空航天中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100049)

細菌對抗菌藥物耐藥形勢嚴峻，耐藥菌造成的復(fù)雜性感染的治療已成為全球衛(wèi)生從業(yè)者共同關(guān)注的焦點。引發(fā)人們擔憂的重要原因是日益加速的全球化的多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥細菌造成的復(fù)雜感染與人類目前非常有限的、甚至是滯后的研發(fā)新型抗菌藥物能力之間的矛盾[1]。按此趨勢發(fā)展下去，人類可能面臨無有效抗菌藥物可用的處境。應(yīng)對耐藥性危機，除研發(fā)新型抗菌藥物外，更需要在規(guī)范抗菌藥物臨床使用、降低醫(yī)院致病菌感染傳播以及預(yù)防耐藥性形成等重要環(huán)節(jié)加強管控。因此，研究細菌對抗菌藥物的耐藥機制，特別是近年來受到高度關(guān)注的機制具有重要的意義。

作為我國重要醫(yī)院致病菌的ESKAPE(即腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬)之一，廣泛分布于自然環(huán)境的鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii, AB)是引發(fā)醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機相關(guān)肺炎的重要致病菌，特別容易感染患有嚴重基礎(chǔ)性疾病、前期接受過抗菌藥物治療的重癥監(jiān)護病房(ICU)患者，大大增加其發(fā)生醫(yī)院感染的概率，有增加病死率的風險[2-3]。AB“與生俱來”的強大的獲得耐藥性和克隆傳播的能力引起多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥菌株在世界范圍內(nèi)廣泛流行[4]，一段時間內(nèi)在中國更是被稱為“超級細菌”，耐藥形勢非常嚴俊[5]，特別是對作為抗革蘭陰性菌感染治療最后一道防線的碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年升高，耐藥率大多在65%以上[6]。面對耐藥AB造成的復(fù)雜感染，臨床醫(yī)生在診治和防控中面臨諸多難題。

1 AB耐藥機制復(fù)雜

AB耐藥機制非常多樣化，革蘭陰性菌主要的耐藥機制在AB中均已得到驗證。例如獲得產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶[7]：最具代表性也最常見的碳青霉烯水解酶D類β-內(nèi)酰胺酶(carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamases, CHDLs)或稱為苯唑西林水解酶(oxacillinases, OXA)是OXA-23酶[8]、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)、頭孢菌素酶AmpC(Acinetobacter-derived cephalosporinases, ADCs)和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases, MBLs)；藥物作用靶位改變，如拓撲異構(gòu)酶gyrA、parC 基因突變導致的對喹諾酮類抗菌藥物耐藥，16S rRNA 甲基化酶(arm A基因)導致幾乎對所有氨基糖苷類抗生素耐藥[9-10]；通過降低抗菌藥物濃度而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，例如以RND系統(tǒng)為代表的外排泵高表達[11-12]以及細菌生物被膜的形成[13]等；此外，整合子系統(tǒng)與耐藥性的傳播[14]在AB耐藥機制中均發(fā)揮著重要作用。

2 細菌異質(zhì)性耐藥

除上述近些年研究較多的耐藥機制，異質(zhì)性耐藥這一現(xiàn)象在包括AB在內(nèi)的多種革蘭陰性菌中被越來越多的報道。異質(zhì)性耐藥(heteroresistance)是指細菌內(nèi)部的不同亞群對某種抗菌藥物表現(xiàn)出不同的敏感性[15]。相較常規(guī)藥敏試驗結(jié)果認定的細菌對抗菌藥物的敏感、耐藥或者中介等狀態(tài)，異質(zhì)性耐藥更加強調(diào)各狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化和過渡。通過采用特殊的檢測方法，在部分常規(guī)藥敏試驗表現(xiàn)為敏感，但抗菌藥物治療效果不佳的臨床患者分離培養(yǎng)的細菌中可檢測到耐藥甚至表現(xiàn)出極高耐藥性的亞群，正是這部分耐藥亞群可能導致了抗菌藥物治療的失敗[16]。異質(zhì)性耐藥體現(xiàn)了細菌群體從部分耐藥向完全耐藥轉(zhuǎn)變的過程。研究異質(zhì)性耐藥對于認識致病菌耐藥的發(fā)展過程，以及評估治療方案和指導臨床使用抗菌藥物具有重要的意義[17]。

異質(zhì)性耐藥這一現(xiàn)象早在1947年就被發(fā)現(xiàn)，且在革蘭陰性菌和陽性菌中均存在。目前研究較多的是異質(zhì)性萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(heterogenous vancomycin-intermediateStaphyloccusaureus, hVISA)，美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)對其定義及檢測方法都有明確的介紹，且已有國際標準株(Mu3)[18]。hVISA在世界各國和地區(qū)都有報道，但發(fā)生率有明顯差異[19]。雖然缺乏關(guān)于hVISA感染與臨床病死率的直接證據(jù)，但是該菌感染將導致患者住院時間延長，基礎(chǔ)疾病加重，增加患者的經(jīng)濟負擔，以及導致身體和精神上的雙重痛苦，因此，hVISA越來越被人們關(guān)注。

3 AB異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

近年來，包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等在內(nèi)的革蘭陰性菌異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象不斷被報道[20-23]，其中關(guān)于AB異質(zhì)性耐藥的研究更是明顯增多，主要集中在頭孢菌素、青霉素、多粘菌素及碳青霉烯等幾類臨床最常用的抗生素。這些研究揭示AB異質(zhì)性耐藥發(fā)生率很高，并最終將導致臨床抗感染治療的失敗，造成多重耐藥AB在醫(yī)院內(nèi)普遍流行。

3.1 AB異質(zhì)性耐藥的定義和檢測方法 雖然對AB異質(zhì)性耐藥的研究不斷增多，但是其中的一些關(guān)鍵科學問題尚不明確，導致對其認識存在一定的偏差。到目前為止，關(guān)于AB異質(zhì)性耐藥定義及檢測方法缺乏像hVISA統(tǒng)一的標準，特別是明確的抗菌藥物濃度說明。最初一些報道只關(guān)注某株細菌對某種抗菌藥物耐藥或敏感變化的濃度折點，例如之前一項基于AB對多粘菌素的異質(zhì)性耐藥研究認為，微量肉湯稀釋法確認的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為8 μg/mL，那么能夠在含8 μg/mL多粘菌素的平板上生長的AB即是對多粘菌素異質(zhì)性耐藥的菌株[24]。此顯然未考慮細菌內(nèi)部存在對抗菌藥物不同敏感性的亞群情況。

目前對異質(zhì)性耐藥AB的篩選方法主要有E-test試劑條法、紙片藥敏擴散實驗和改良的菌譜分析法(modified population analysis profiling, mPAP)。前兩種方法依靠肉眼觀察在培養(yǎng)皿抑菌環(huán)內(nèi)是否有菌落生長，如果有可判斷為對某種藥物的異質(zhì)性耐藥菌株。該方法優(yōu)點是操作簡單，結(jié)果判讀一目了然；缺點是沒有判斷標準，僅依賴主觀判斷，無法判斷耐藥亞群出現(xiàn)頻率，而且很可能遺漏對抗菌藥物敏感性差異較小的不同群譜。菌群譜型分析法(population analysis profiling, PAP)被認為是鑒定異質(zhì)性耐藥細菌的金標準，而mPAP-曲線下面積法(modified PAP assay comparing the area under the curve, PAP-AUC)也是CLSI推薦的鑒定hVISA的方法?；谠摲椒ㄟM一步簡化的PAP已被不同實驗室運用于AB異質(zhì)性耐藥菌株的鑒定[25-27]，具體方法是：將培養(yǎng)到一定濁度的AB(108CFU/mL)做連續(xù)的10倍稀釋，取一定量的各個濃度細菌懸液分別涂布到(2倍稀釋)含不同濃度抗菌藥物固體(液體)培養(yǎng)基中，35℃孵育24～48 h。之后對平板上的菌落(或混合液濁度)進行計數(shù)，并取菌落數(shù)的對數(shù)(或濁度)作菌譜分析圖，計算耐藥亞群出現(xiàn)頻率——能在高于其MIC濃度培養(yǎng)基中長出克隆，且達到一定的出現(xiàn)頻度，即判斷為異質(zhì)性耐藥菌株。但是該方法非常繁瑣費時，且缺乏統(tǒng)一的操作指導。

隨后，El-Halfawy[15, 28]給出一個更為詳細的兩步法鑒定方案：首先采用E-test試劑條法、紙片藥敏擴散，觀察抑菌圈內(nèi)是否有菌落生長，如果有，可初步判斷為異質(zhì)性耐藥菌株；如果無，認為是均質(zhì)性耐藥。第二步，對異質(zhì)性耐藥菌株采取PAP進一步鑒定，其最大程度抑制細菌生長的MIC與完全不抑制細菌生長的最高抗菌藥物濃度相差>8倍的細菌，確定為對某種抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的細菌；≤4倍則認為均質(zhì)性耐藥，等于8倍為中介異質(zhì)性耐藥。該方案結(jié)合了常用的幾種篩選異質(zhì)性耐藥細菌的方法，在最大程度上避免了可能出現(xiàn)的人為誤差，且可以通過客觀的數(shù)據(jù)判讀結(jié)果，操作相對簡單，是目前對AB異質(zhì)性耐藥鑒定的一個較好方法[29]。

3.2 AB對多粘菌素、碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀 如前所述，目前對AB異質(zhì)性耐藥的報道主要集中在頭孢菌素和青霉素[27]、多粘菌素[24-25, 30-33]及碳青霉烯[26, 34-38]等幾類臨床最常用的抗生素，其中尤以基于后兩類抗生素研究較多。Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，16株對多粘菌屬敏感的AB(MIC為0.25～2 μg/mL)中，有15株的少數(shù)亞群能夠在含3～10 μg/mL的多粘菌素培養(yǎng)基中生長，且這些亞群在多粘菌素壓力作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢菌群，從而表現(xiàn)出對多粘菌素完全耐藥。研究者同時警告說，常規(guī)推薦劑量的多粘菌素對異質(zhì)性耐藥細菌引發(fā)的感染并不是最佳治療方案。后續(xù)研究[25]證實，接受過多粘菌素抗感染治療的患者，其檢測物中分離出的AB發(fā)生多粘菌素異質(zhì)性耐藥概率要高得多。近年來的研究[31]揭示，在臨床分離的對多粘菌素敏感的AB中，異質(zhì)性耐藥率非常高，甚至高達83%。

Hung 等[27]報道了2株對頭孢菌素和青霉素異質(zhì)性耐藥的AB。在PAP實驗中，兩株菌均出現(xiàn)雙峰，在兩個頭孢吡肟濃度相差很大(1 μg/mL和256 μg/mL)的培養(yǎng)環(huán)境中都有菌落生長。但異質(zhì)性耐藥菌落明顯較敏感菌落生長緩慢，可能也是異質(zhì)性耐藥亞群逃避抗菌藥物壓力的一種策略。

碳青霉烯類抗生素曾被認為是針對AB復(fù)雜感染的最后一道防線。近年來，針對碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥的報道也在逐年增多。Pournaras等[34]采用E-test方法檢測亞胺培南和美羅培南的MIC值時發(fā)現(xiàn)，其中8株對碳青霉烯類敏感的AB抑菌圈內(nèi)均有菌落生長，推測在這些AB克隆中存在異質(zhì)性耐藥亞群，而且認為正是由于這些亞群的出現(xiàn)造成這幾例感染患者對碳青霉烯類抗生素治療無效。之后該研究小組[26]又發(fā)現(xiàn)在對美羅培南敏感的AB中同樣存在異質(zhì)性耐藥亞群，而且這些亞群可被高濃度抗生素篩選出來，成為優(yōu)勢亞群，從而使整個細菌表現(xiàn)為耐藥菌，致使抗感染治療失敗。西班牙學者Superti等[35]的研究也報道了在紙片擴散法檢測1株AB對亞胺培南和美羅培南敏感性時，在抑菌圈內(nèi)有菌落生長的臨床案例。PCR檢測編碼常見的碳青霉烯類相關(guān)耐藥基因，只有blaOXA-51陽性。該國另一個研究小組[36]收集了西班牙多所醫(yī)院來源的221株AB，其中20%菌株對亞胺培南異質(zhì)性耐藥，24%對美羅培南異質(zhì)性耐藥，且這種異質(zhì)性耐藥的AB在西班牙國內(nèi)普遍流行。Lee等[37]的研究進一步證實，持續(xù)使用亞胺培南是導致AB由敏感變成耐藥的最重要原因。該研究小組采用El-Halfawy推薦的鑒定方法，發(fā)現(xiàn)幾株對亞胺培南異質(zhì)性耐藥的AB，并對其中1株HRAB-85進行全基因組檢測。全基因組大小為4 098 585 bp，CG含量39.98%，基因組包含1個質(zhì)粒，11個基因島，19個耐藥基因，以及以ISAba1、ISAba22、ISAba24和ISAba26為代表的插入序列[38]。此可能是對碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥AB全基因組的首次報道。

從以上報道不難發(fā)現(xiàn)，存在異質(zhì)性耐藥的AB，在給予持續(xù)的、不恰當劑量的抗菌藥物時，會篩選出耐藥亞群，并使之轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢菌群，在短時間內(nèi)使整個菌群變?yōu)閷υ摽咕幬锬退幍募毦?，最終導致抗菌藥物治療無效。因此，臨床應(yīng)高度重視AB異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。

3.3 AB異質(zhì)性耐藥機制有關(guān)研究 雖然人們逐漸認識到異質(zhì)性耐藥可能是導致臨床抗菌治療失敗的原因之一，且越來越多的人關(guān)注到此現(xiàn)象，但是目前有關(guān)其耐藥機制的研究才剛剛起步。其中，關(guān)于AB異質(zhì)性耐藥機制的研究需要探討的問題更多。目前比較肯定的有以下幾點：(1)AB異質(zhì)性耐藥亞群的穩(wěn)定性在不同菌群中表現(xiàn)完全不同。有的菌株在無抗菌藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)幾代，抗性會逐漸減小甚至消失，有的抗性則非常穩(wěn)定。Ikonomidis等[26]研究表明，對碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥的AB亞群可以在2～16倍MIC的藥物濃度下生長；但在無抗菌藥物的培養(yǎng)液中連續(xù)傳代7 d后，這些亞群又可對亞胺培南和美羅培南敏感，猜想這種藥物敏感性的改變主要是由于AB在抗菌藥物壓力下表達了“可誘導的耐藥性”，而且這種耐藥性不穩(wěn)定。而筆者課題組篩選到的HRAB-85，在不含亞胺培南的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7代以上，其MIC值幾乎無變化[38]。(2)與其他細菌耐藥機制相似，AB的異質(zhì)性耐藥可能是自發(fā)突變的，也可以后天獲得。關(guān)鍵耐藥基因或者相關(guān)調(diào)控基因的突變或拷貝數(shù)的改變，完全可導致細菌內(nèi)部亞群表現(xiàn)出不同的藥物敏感性，這種差異遺傳給下一代，可導致細菌出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥[15, 39]。雖然目前沒有野生型異質(zhì)性耐藥AB的報道，但是天然存在耐藥相關(guān)突變基因?qū)е陆Y(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼及喹諾酮等抗結(jié)核藥物的異質(zhì)性耐藥已經(jīng)得到證實[40-41]。外界因素，如長期使用某種抗菌藥物，可引起原本敏感的細菌對該抗菌藥物產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥[37]。在長時間的抗菌藥物選擇性壓力作用下，可導致細菌基因組不穩(wěn)定，通過能夠在DNA分子內(nèi)或DNA分子間移動的可移動遺傳元件以及能夠在細菌間移動的基因元件的協(xié)同活動，促進抗性基因的獲得和傳播，導致耐藥表型的變化。耐藥性亞群得以生存，并且隨著抗菌藥物使用時間的延長，這種耐藥亞群數(shù)量積累到一定程度，達到耐藥菌檢測的標準。這種情況在缺乏“自我糾錯”能力的AB中更為常見，容易獲得外源性耐藥元件已成為AB耐藥的一個重要原因。因此，后天獲得性異質(zhì)性耐藥在AB的異質(zhì)性耐藥中發(fā)揮著重要作用。Ikonomidis等[26]認為對美羅培南敏感的AB中存在異質(zhì)性耐藥與AmpC在耐藥亞群中的過表達有關(guān)系。Fernández等[36]篩選的異質(zhì)性耐藥菌株中檢測到攜帶編碼blaOXA-58類耐藥基因、插入序列 ISAba2 和ISAba3的概率高于普通菌株。Lee等[37]收集的絕大多數(shù)對亞胺培南異質(zhì)性耐藥的AB菌株攜帶blaADC-29耐藥基因，且其上游有插入序列ISAba1；體外實驗表明，這種異質(zhì)性耐藥與亞胺培南誘導的blaADC-29基因過表達有關(guān)。這是目前AB對碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥研究中唯一給出的比較肯定的結(jié)果，但尚未得到廣泛認可。筆者實驗室篩選的HRAB-85亦包含11個基因島，19個耐藥基因，以及以ISAba1、ISAba22、ISAba24和ISAba26為代表的多個插入序列，但這些耐藥元件在碳青霉烯類耐藥的AB中亦非常常見，其與異質(zhì)性耐藥的關(guān)系尚需在更多異質(zhì)性耐藥菌株中驗證。此外，有文獻[42]報道，AB對多粘菌素出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥是由于細菌失去脂多糖(LPS)，而導致這種改變的原因是參與類脂A合成的兩個關(guān)鍵基因lpxA和lpxC的失活。而最近的一項研究[33]表明，PmrAB調(diào)節(jié)途徑中某些關(guān)鍵基因的突變可能是導致多粘菌素異質(zhì)性耐藥的原因，比如pmrA基因中的M12I突變，pmrB基因中的M308R、S144KLAGS以及P170L突變與AB對多粘菌素的異質(zhì)性耐藥相關(guān)。

總之，隨著AB耐藥形式日趨嚴峻，越來越多的臨床工作者更加關(guān)注如何合理使用抗菌藥物，盡量減少耐藥菌株的出現(xiàn)。由于異質(zhì)性耐藥這一特殊的耐藥現(xiàn)象的存在，其利用常規(guī)藥敏試驗很難被發(fā)現(xiàn)，導致臨床不恰當?shù)挠盟幏桨?。因此，及時監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥AB具有非常重要的意義。但遺憾的是，目前還沒有規(guī)范的鑒定異質(zhì)性耐藥AB的方案，其耐藥機制的研究也才剛剛起步。因此，對AB異質(zhì)性耐藥還有大量未知領(lǐng)域需要人們?nèi)ヌ剿鳌?/p>