RNA干擾在破骨細(xì)胞分子調(diào)控應(yīng)用的研究進(jìn)展

張譽(yù)泓 戚孟春* 董偉 張明洋

1．華北理工大學(xué)博創(chuàng)口腔醫(yī)院，河北唐山063000

2．華北理工大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000

RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象最早是在1990年Jorgensen研究加深矮牽?；ɑㄉ膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，該研究在大量引入同源編碼基因后出現(xiàn)了白色的花朵，這種現(xiàn)象被稱(chēng)作共抑制現(xiàn)象［1］。隨后，F(xiàn)ire等在研究秀麗新小桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，在給予線蟲(chóng)注射雙鏈RNA后出現(xiàn)的基因沉默現(xiàn)象比注射單鏈正義或反義RNA更有效，并將此現(xiàn)象首次命名為RNAi［2］。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收是近些年的研究熱點(diǎn)，本文總結(jié)了在破骨細(xì)胞分子調(diào)控中采用RNAi技術(shù)的應(yīng)用，以期為科研工作者采用RNAi技術(shù)對(duì)破骨細(xì)胞的研究提供一定的參考。

1 RNAi的作用機(jī)制及優(yōu)缺點(diǎn)

作用機(jī)制:RNAi的過(guò)程包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段［3］;在RNA干擾過(guò)程中有兩種作用的分子，分別是小分子干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)和微小 RNA(microRNA，miRNA)。①起始階段:雙鏈RNA(dsRNA)經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)具有核糖核酸酶Ⅲ活性的Drosha蛋白和Dicer酶識(shí)別內(nèi)源或/和外源性dsRNA，并將其切割成為21～25個(gè)核苷酸的 siRNA或 miRNA。②效應(yīng)階段:siRNA/miRNA通過(guò)運(yùn)載蛋白-5以及TRBP蛋白的作用下與具有裂解dsRNA活性的Argonaute2(AGO2)蛋白結(jié)合，組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，誘導(dǎo)基因沉默。具體是在解旋酶的作用下siRNA解螺旋，其反義鏈與靶基因mRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合，并活化RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，最終將靶基因mRNA剪切為碎片［4］。③擴(kuò)增階段:siRNA作為引物，靶基因mRNA作為模板，在RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的作用下形成新的dsRNA，然后再重復(fù)經(jīng)過(guò)起始階段及效應(yīng)階段，如此循環(huán)往復(fù)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)擴(kuò)增效應(yīng)，加強(qiáng)靶基因的沉默效應(yīng)。

RNAi具備以下優(yōu)點(diǎn):高特異性、內(nèi)在生物學(xué)反應(yīng)［5］和高效性，因此可作為多種類(lèi)型細(xì)胞信號(hào)研究的篩選與驗(yàn)證工具。RNAi應(yīng)用的主要問(wèn)題是能否特異性地遞送到靶向組織中，并長(zhǎng)時(shí)間有效。病毒和非病毒載體可用以解決細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的問(wèn)題，非病毒傳遞在靶向、轉(zhuǎn)染和表達(dá)方面效率極低，但是病毒載體存在如安全問(wèn)題、病毒毒性高、可能致癌、已證實(shí)的免疫原性和成本限制等問(wèn)題［6-7］。

2 RNAi在破骨細(xì)胞的有效靶點(diǎn)

破骨細(xì)胞由核因子 B配體激活受體(RANKL)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)刺激分化產(chǎn)生。破骨細(xì)胞的分化吸收又受到相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，RANKL-RANK-OPG是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的重要途徑，Ca2+/Calmodulin/NFATc1是破骨細(xì)胞生成的重要信號(hào)通路，骨質(zhì)的降解依賴(lài)于骨吸收微環(huán)境的酸化以及破骨細(xì)胞分泌的各種酶類(lèi)。

2.1 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)

RANK作為RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)和RANK信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)，在破骨細(xì)胞分化中起著主要作用，RNAi沉默RANK可以明顯抑制小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及活化［8］。體外選擇性敲除小鼠骨髓細(xì)胞RANK基因能顯著阻斷酒石酸耐酸性磷酸酶的形成［9］。這些增進(jìn)了科研者對(duì)于開(kāi)發(fā)靶向RANK藥物的熱情。

2.2 Ca2+/Calmodulin/NFATc1信號(hào)通路

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Ca2+/Calmodulin/NFATc1是破骨細(xì)胞生成的重要信號(hào)通路，對(duì)OC分化及骨吸收發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用［10-12］。在 Calmodulin下游，CaMKs是calcineurin之外的另一類(lèi)信號(hào)分子，在鈣信號(hào)傳遞中負(fù)責(zé)下游許多信號(hào)蛋白的活化(磷酸化)，對(duì)OC分化及許多特異基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用。通過(guò)RNAi敲除CaMK抑制了破骨細(xì)胞的生成［13］，CaMKs 包括 CaMKI、CaMKII、CaMKIV 3 種亞型，對(duì) OC分化起作用的主要是 CaMKII和CaMKIV［14］;CaMKIV基因敲除可使OC生成數(shù)目顯著下降［15］，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì) CaMKIIγ、CaMKIIδ 進(jìn)行RNA干擾可顯著抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能［16-17］;NFATC1是破骨細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為在破骨細(xì)胞形成中起著重要作用。小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)中采用RNAi特異性敲除NFATc1導(dǎo)致成熟破骨細(xì)胞的形成減少，并且明顯降低破骨細(xì)胞特異性基因TRAP和組織蛋白酶K的表達(dá)［18］，這些研究結(jié)果表明RNAi對(duì)于破骨細(xì)胞的基因敲除發(fā)揮一定的作用。

2.3 骨吸收微環(huán)境的酸化

微環(huán)境發(fā)生酸化是啟動(dòng)酶降解骨基質(zhì)的前提，骨吸收陷凹內(nèi)的低pH(4～6)環(huán)境是由V-ATP酶質(zhì)子泵形成的，可以通過(guò)抑制V-ATP酶等方法來(lái)阻止褶皺緣外的微環(huán)境pH的降低來(lái)降低破骨細(xì)胞的溶骨能力。Ac45(Atp6ap1)是V-ATP酶復(fù)合物的組成成分，負(fù)責(zé)酸化和內(nèi)吞作用。Ac45基因?qū)τ谄乒羌?xì)胞維持正常的骨吸收功能是必需的。體外和體內(nèi)RNAi敲除Ac45基因后，明顯破壞了破骨細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外酸化及骨吸收［19］。RNAi介導(dǎo)的Atp6i沉默阻止小鼠骨性根尖周炎的骨侵蝕與牙髓病炎癥反應(yīng)［20］，靶向Atp6i防止炎癥和牙周炎引起的骨侵蝕并揭示其在骨免疫中的重要作用［21］，上述研究均揭示了使用RNAi技術(shù)靶向抑制AC45影響破骨細(xì)胞骨吸收的良好效果。

2.4 破骨細(xì)胞分泌的組織蛋白酶K及DC-STAMP蛋白

細(xì)胞分泌多種溶酶體酶，破骨細(xì)胞動(dòng)員骨礦物質(zhì)之后，幾種水解酶會(huì)降解有機(jī)骨組分。參與該過(guò)程的主要蛋白酶是組織蛋白酶K(Cathepsin K)，并且Cathepsin K是破骨細(xì)胞的主要標(biāo)志物，RNAi靶向Cathepsin K破壞破骨細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮骨吸收功能，并且可以減少88%的細(xì)菌感染刺激的骨吸收［22］?？梢?jiàn)RNAi的立桿見(jiàn)影的影響。

樹(shù)突狀細(xì)胞-特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)是介導(dǎo)人類(lèi)無(wú)骨吸收能力的單核破骨細(xì)胞前體融合為具有骨吸收能力的多核破骨細(xì)胞所必需的關(guān)鍵性蛋白質(zhì)。慢病毒其所介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)成功抑制了DC-STAMP表達(dá)，抑制了破骨細(xì)胞的生成［23-24］。

總之，RNAi在破骨細(xì)胞分子調(diào)控的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，這有可能成為未來(lái)破骨細(xì)胞分子水平研究的主要科研工具。

3 展望與結(jié)論

RNAi作為一種新型的干預(yù)方法對(duì)于沉默異?；蚓哂邢喈?dāng)大的潛力，特別是對(duì)于常規(guī)治療無(wú)法有效靶向的基因靶標(biāo)，它已被廣泛用于功能基因組學(xué)研究［25］、醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)、全基因組篩選等。RNAi在研究破骨細(xì)胞分子調(diào)控中的應(yīng)用將會(huì)不斷出現(xiàn)，RNAi可作為今后研究人類(lèi)破骨細(xì)胞相關(guān)基因功能的理想工具。