環(huán)狀RNA與骨科相關(guān)疾病研究進(jìn)展

陳德龍 陳鵬 王粵淇 王海彬

1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405

2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405

非編碼 RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子，近20年來，具有調(diào)控作用的非編碼RNA分子被發(fā)現(xiàn)及其功能研究，大大改變了人們對RNA分子的認(rèn)知，也極大深化了人們對基因表達(dá)調(diào)控的理解。其中，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類通常由一個(gè)以上外顯子構(gòu)成的環(huán)形RNA分子，概念最初是由Sanger等［1］于1976年提出的，他發(fā)現(xiàn)某些高等植物的類病毒是單鏈、共價(jià)閉合的環(huán)狀 RNA分子。然后在1979年通過使用電子顯微鏡驗(yàn)證了環(huán)狀RNA存在于幾個(gè)真核細(xì)胞中［2］。1986年，在感染丁型肝炎病毒后，人類首次觀察到circRNA［3］。在真核生物中，規(guī)范剪接由剪接體去除內(nèi)含子并將外顯子連接成線性 RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。20多年前，Nigro等［4］發(fā)現(xiàn)circRNA時(shí)，人們認(rèn)為它是錯(cuò)誤剪接生成的副產(chǎn)品或逃逸內(nèi)含子套索的中間產(chǎn)物。自2012年以來，隨著生物信息學(xué)和高通量測序的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，這種觀點(diǎn)發(fā)生了巨大變化［5］。最近的許多報(bào)道證明了circRNA在病理生理學(xué)中的重要性，這些circRNA可以作為 miRNA海綿發(fā)揮作用［6-7］，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)［8-9］，有些甚至翻譯成蛋白質(zhì)［10-11］。circRNA參與各種疾病的發(fā)病機(jī)制，具有序列高度保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高、有一定的組織特異性和疾病特異性［12］，使它們成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。circRNA作為疾病診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)也具有潛在的價(jià)值［13］。本文簡要描述了circRNA的特征、生物起源、分類和功能，并且強(qiáng)調(diào)了circRNA與多種骨科疾病之間的關(guān)系。

1 circRNA的特征

circRNA廣泛存在于真核細(xì)胞中，通常由1～5個(gè)外顯子產(chǎn)生［14］，主要位于細(xì)胞質(zhì)中［5］，少部分含有內(nèi)含子的circRNA起源于細(xì)胞核［9］。circRNA的長度在幾百到幾千個(gè)核苷酸之間［15］，平均547個(gè)核苷酸［14］，大多數(shù)circRNA的半衰期超過48 h。重要的是，circRNA來自非規(guī)范的可變剪接，其將剪接供體連接至上游剪接受體并形成共價(jià)閉合環(huán)，沒有5’帽子或3’多聚A尾，并通過共價(jià)鍵環(huán)化。這些特征賦予circRNA對核酸外切酶RNase R的抗性，在組織和血漿中更穩(wěn)定。而且circRNA在細(xì)胞、組織中廣泛表達(dá)［16-17］，具有成為生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的潛力。

2 circRNA的分類

circRNA的生成與可變剪接相關(guān)，而可變剪接是真核基因表達(dá)中必不可少的步驟，它受到剪接體和核糖酶的調(diào)控。circRNA由外顯子、內(nèi)含子、基因間區(qū)域、以及 5’或 3’非翻譯片段產(chǎn)生［9，18］。circRNAs主要分為3類:外顯子環(huán)狀 RNA(exonic circular RNAs，ecircRNAs)、內(nèi) 含 子 環(huán) 狀 RNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀 RNA(exon-intron circular RNAs，EIciRNAs)。

3 circRNA的生物起源

3.1 ecircRNA的生物起源

大多數(shù)ecircRNA來自外顯子，關(guān)于ecircRNA生物合成已經(jīng)提出了3個(gè)主要模型:(1)套索驅(qū)動環(huán)化(也稱為外顯子跳躍)。它是位于5’端的外顯子受體和位于3’端外顯子供體兩者共價(jià)結(jié)合后形成含外顯子的套索中間體，然后去除套索中的內(nèi)含子以產(chǎn)生ecircRNA［12］。(2)內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化(也稱為直接反向剪接)。通過側(cè)翼內(nèi)含子的直接堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后切除環(huán)內(nèi)反向剪接的內(nèi)含子，從而產(chǎn)生ecircRNA［12］。(3)重新剪接驅(qū)動環(huán)化。在通過經(jīng)典前mRNA剪接合成成熟mRNA后，發(fā)生反向剪接和環(huán)化，導(dǎo)致ecircRNA形成［19］。一些RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)在此過程中充當(dāng)調(diào)節(jié)因子，例如muscleblind(MBL)剪接因子可以將側(cè)翼內(nèi)含子生成的circMbl前體環(huán)化成circMbl，并且circRNA的生成受到MBL表達(dá)水平的調(diào)控［20］。RBP與前mRNA的側(cè)翼內(nèi)含子內(nèi)的特定序列結(jié)合，可以通過穩(wěn)定剪接或抑制線性RNA來調(diào)節(jié)circRNA形成。

3.2 其他類型circRNA的生物起源

EIciRNA的生物合成與ecircRNA過程類似，唯一的區(qū)別在于內(nèi)含子是完全剪接(ecircRNA)或部分剪接(EIciRNA)。與外顯子circRNA形成不同，ciRNA的產(chǎn)生主要取決于內(nèi)含子兩端的共有基序，即5’剪接位點(diǎn)附近存在一段7nt左右富含GU堿基的結(jié)構(gòu)，分支點(diǎn)附近存在一段11nt左右富含C堿基的結(jié)構(gòu)。因此，ciRNA不是以3’-5’磷脂結(jié)合，而是以 2’-5’磷脂連接［9］。

4 circRNA生物學(xué)功能

4.1 調(diào)節(jié)線性RNA轉(zhuǎn)錄

circRNA影響剪接過程，是選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它們不僅可以增強(qiáng)線性RNA的轉(zhuǎn)錄，而且還能抑制它們的轉(zhuǎn)錄。外顯子circRNAs是主要種類，在合成過程中與規(guī)范剪接互相競爭(見圖1)。一方面，規(guī)范剪接修飾前mRNA，形成線性RNA，外顯子對這一過程必不可少;另一方面，當(dāng)circRNA和線性RNA的形成需要共同的外顯子時(shí)，需要相互競爭。此外，這兩個(gè)過程可能共享相同的位置［21］。對于由內(nèi)含子(如ciRNA和EIciRNA)形成的circRNA，一些研究揭示了這些circRNAs能調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)。已經(jīng)證明的ciRNA或EIciRNA，例如c-sirt7可以與聚合酶II復(fù)合物相互作用，相應(yīng)基因錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域52(ankyrin repeat domain 52，ANKRD52)和去乙酰化酶 7(sirtuin 7，SIRT7)的表達(dá)水平下降［22］。如上所述，在circRNA形成期間，調(diào)節(jié)其親本基因的表達(dá)，這是circRNA在其他功能中發(fā)揮作用的先決條件之一。

4.2 miRNA海綿

miRNA作為在轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，它可以根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合到互補(bǔ)的mRNA位點(diǎn)上［23-24］，miRNA的改變會調(diào)控mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。circRNA是一種擁有miRNA反應(yīng)原件(microRNA response element，MREs)的競爭性內(nèi)源性 RNA分子，具有 miRNA海綿作用。ceRNA的缺失和出現(xiàn)會通過影響miRNA功能活性從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。具有互補(bǔ)序列的circRNA可以與其靶miRNA結(jié)合，從而抑制這些miRNA的功能［25］。然而，海綿作用是否是circRNA的普遍功能仍在討論中。

圖1 CircRNA生物學(xué)功能示意圖(自擬)Fig．1 Biological function of circRNA

CiRS-7也稱為CDR1as，已經(jīng)被證明可以作為miRNA海綿的典型例子［26-27］。具有超過70個(gè)常規(guī)miR-7結(jié)合位點(diǎn)的CiRS-7由CDR1as基因的反義轉(zhuǎn)錄物形成［26］。此外，CIR-7不能被miRNA-7介導(dǎo)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物體(RNA-induced silencing complex，RISC)降解［28］。miR-7 是眾多信號通路中的關(guān)鍵參與者之一，ciRS-7-miR-7軸廣泛表達(dá)于各種癌癥，如非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌［29-30］。

4.3 蛋白質(zhì)海綿

circRNA還可以作為RNA結(jié)合蛋白的海綿來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平。RBP可參與許多生物活性，例如細(xì)胞增殖、分化，細(xì)胞凋亡、衰老，細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。據(jù)報(bào)道，circRNA可以結(jié)合多個(gè)RBPs，例如 RNA 聚合酶 II(RNA polymerase II，Pol II)、Argonaute(AGO)蛋白、MBL、RNA結(jié)合蛋白Quaking(QKI)等，通過相互作用形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種與RBPs的相互作用類似與miRNA海綿，導(dǎo)致RBPs的消耗和減少與RNA靶標(biāo)的互相作用。在蒼蠅和人類中發(fā)現(xiàn)的circMBL可以在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合MBL蛋白［25］。另外，CDR1As可以連接和切割miRNA AGO蛋白，抑制其翻譯并促進(jìn)其降解［18］。

4.4 與蛋白質(zhì)相互作用

circRNA可以與蛋白質(zhì)相互作用以影響細(xì)胞行為。例如circ-FOXO3通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和 CDK 抑制劑P21結(jié)合，阻礙CDK2使細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E磷酸化，從而抑制細(xì)胞周期［31］。

4.5 蛋白質(zhì)翻譯

circRNA可能不是真正的一類ncRNA，因?yàn)槠渲杏幸恍ヽircRNA可以翻譯蛋白質(zhì)。早在1995年，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)circRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)元件時(shí)，真核生物核糖體能啟動翻譯［32］。當(dāng)將IRES插入含有裂解GFP的小基因中時(shí)，得到的circRNA能產(chǎn)生大量的GFP蛋白［33］。盡管已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，但是circRNA的翻譯細(xì)節(jié)仍然未知，仍需進(jìn)一步探索。

5 circRNA在骨科方面的運(yùn)用

5.1 骨細(xì)胞

轉(zhuǎn)錄因子BMP2屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族，是重要的人類細(xì)胞因子之一。它能誘導(dǎo)骨和軟骨形成，并在胚胎生長、細(xì)胞生長和分化、骨發(fā)育和骨折修復(fù)中發(fā)揮重要作用。用BMP2處理的MC3T3-E1細(xì)胞共有158個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中74個(gè)上調(diào)，84個(gè)下調(diào)。在 BMP2處理后，PCR驗(yàn)證 hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和 hsa_circ_0010042的表達(dá)顯著增加。hsa_circ_0005846和hsa_circ_0 019 142分別與51和21個(gè)miRNA相互作用，并且都海綿樣作用于 miR-7067-5p，參與 FGF、EGF、PDGF 和Wnt信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化［34］。

在小鼠破骨細(xì)胞發(fā)育的不同階段存在共同表達(dá)的circRNA。circRNA-miRNA協(xié)同作用在破骨細(xì)胞形成中起重要作用。對于破骨細(xì)胞前期，147個(gè)circRNA和119個(gè)miRNA上調(diào)，109個(gè)circRNA和941個(gè)miRNA下調(diào)。對于成熟的破骨細(xì)胞，78個(gè)circRNA和38個(gè)miRNA上調(diào)，135個(gè)circRNA和24個(gè)miRNA下調(diào)。對于活化的破骨細(xì)胞，111個(gè)circRNA和94個(gè)miRNA上調(diào)，45個(gè)circRNA和975個(gè)miRNA下調(diào)。在OC發(fā)生過程中的所有階段，19個(gè)circRNAs和22個(gè)miRNAs都上調(diào)，5個(gè)circRNAs和 15miRNAs都下調(diào)［35］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞，廣泛運(yùn)用于組織工程研究，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化是骨再生的希望。Zhang等［36］利用RNA-seq技術(shù)探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化過程中明顯異常表達(dá)的circRNAs和miRNAs，在第0天和第7天的比較中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的共有3 938個(gè)上調(diào)的circRNAs，1 505個(gè)下調(diào)的circRNAs和42個(gè)上調(diào)的miRNAs，18個(gè)下調(diào)的miRNAs。通過ALP染色和茜素紅染色證實(shí)沉默circIGSF11促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化并增強(qiáng)miR-199b-5p的表達(dá)。

5.2 骨性關(guān)節(jié)炎

人骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)軟骨中存在許多異常表達(dá)的circRNA，這些circRNA可能參與了OA的發(fā)病機(jī)制。在一項(xiàng)研究中，Liu等［37］發(fā)現(xiàn)與正常軟骨相比，總共有71個(gè)circRNA在OA軟骨中差異表達(dá)，其中有16個(gè)上調(diào)，55個(gè)下調(diào)。其中OA中circRNA-CER的表達(dá)是正常組的2.5倍。白介素1(Interleukin-1，IL-1)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是 OA 關(guān)鍵的炎性介質(zhì)，在IL-1和TNFα刺激軟骨細(xì)胞下，CircRNA-CER靶向miR-136調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶 3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)、軟骨Ⅱ型膠原蛋白(collagen type II，COL2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA表達(dá)降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。另一項(xiàng)研究中，在骨關(guān)節(jié)炎病人中，受損的軟骨相比完整的軟骨共有104個(gè)circRNAs差異表達(dá)，其中44個(gè)上調(diào)，60個(gè)下調(diào)。軟骨細(xì)胞在應(yīng)力刺激下，circRNA-MSR表達(dá)增加，并可抑制TNF-α的表達(dá)并增加ECM的形成，增加COL2和Aggrecan的表達(dá)量［38］。

炎癥是OA軟骨病理學(xué)的重要驅(qū)動因素。eNAMPT也被稱為visfatin，在人類OA軟骨細(xì)胞中抑制蛋白多糖的合成并增加基質(zhì)降解酶的表達(dá)。has-circ-0005105不僅可以促進(jìn)NAMPT的表達(dá)，而且可以促進(jìn)前列腺素E2、IL-6和IL-8的產(chǎn)生。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞數(shù)量減少在OA軟骨組織的退化中起重要作用［39］。Li等［40］報(bào)道 has_circ_0045714可通過miR-193b靶基因IGF1R促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

5.3 骨肉瘤

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)已成為兒童及青少年時(shí)期死亡率最高的癌癥，具有局部侵蝕性和易于全身轉(zhuǎn)移的特征。Caspase-1是一種半胱氨酸蛋白酶，已被證明能夠蛋白水解并激活I(lǐng)L-1β和IL-18等炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致形成炎性微環(huán)境，在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)。circ-0016347海綿樣作用于miR-214，上調(diào)具有致癌潛力半胱天蛋白酶-1(caspase-1)的表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤的增殖和侵襲［41］。在骨肉瘤患者中，circHIPK3的表達(dá)與 Enneking分期(P=0.042)和肺轉(zhuǎn)移(P=0.036)顯著相關(guān)。ROC曲線下面積為0.783，靈敏度和特異度分別為0.56和0.84。Kaplan-Maier分析還顯示circHIPK3的低表達(dá)與OS患者的總體存活時(shí)間和預(yù)后較差相關(guān)。此外，功能分析表明circHIPK3過表達(dá)顯著抑制體外OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［42］。在另外一項(xiàng)研究中，circUBAP2可以作為miR-143的海綿發(fā)揮作用并抑制miR-143的表達(dá)，從而上調(diào)骨肉瘤中抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡［43］?？傊?，circRNA在骨肉瘤診斷和預(yù)后方面具有重要價(jià)值，未來的工作中需要更多的樣本來進(jìn)一步確定circRNA的作用。

6 總結(jié)

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，對circRNA的研究越來越受到關(guān)注。circRNA形成的機(jī)制是多種多樣的，產(chǎn)生不同類型的circRNA具有不同的功能，例如調(diào)節(jié)線性RNA轉(zhuǎn)錄、miRNA和蛋白質(zhì)海綿、翻譯蛋白質(zhì)等。這些復(fù)雜的功能使circRNA能夠通過各種信號通路參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，特別是對于骨科疾病，為骨科疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高、有一定的組織特異性和疾病特異性，可能成為臨床診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，但目前均是體外研究，結(jié)果需要在體內(nèi)驗(yàn)證。因此，為了充分了解circRNA在骨科疾病發(fā)展中的分子機(jī)制，必須進(jìn)行更廣泛的研究。