腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛型病證結(jié)合大鼠模型的研究方法*

任培培，汪龍德，劉俊宏，趙 麗，吳亞娜，吳紅莉，楊 博

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州730030; 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730030； 3.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730030)

腸易激綜合征 (irritable bowel syndrome，IBS)是一種功能性腸病,表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、排便異常或排便習(xí)慣改變。該病缺乏可解釋癥狀和生化異常的形態(tài)學(xué)改變[1]，可不同程度地降低生活質(zhì)量，臨床上較難徹底治愈。根據(jù)患者的主要異常排便習(xí)慣,將IBS 分為4個主要的亞型[1],其中腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)最為常見，約占全部IBS患病人群的2/3[2]。中醫(yī)藥治療此病有一定的優(yōu)勢，但缺乏明確的療效機(jī)制，需要開展大量的動物實驗。近年來,為了探索病證結(jié)合動物模型的研制, 許多醫(yī)家進(jìn)行了廣泛的研究, 取得了較理想的成果, 然而仍存在諸多問題有待進(jìn)一步解決。在此，筆者嘗試總結(jié)建立IBS-D肝郁脾虛型動物模型的一般方法和評價體系。

1 疾病模型的建立方法

張北華[3]認(rèn)為，目前IBS-D動物模型多在內(nèi)臟高敏感動物模型的基礎(chǔ)上疊加致瀉因素來造模。常用的造模方法包括：①精神心理應(yīng)激法。包括束縛應(yīng)激、新生期母子分離應(yīng)激、慢性不可預(yù)知應(yīng)激、避水應(yīng)激、游泳致疲勞應(yīng)激、慢性激怒應(yīng)激等。②病原體感染法。常用的病原體有旋毛蟲、彎曲桿菌、志賀痢疾桿菌。③結(jié)腸化學(xué)刺激法。常用的化學(xué)物質(zhì)有醋酸、芥子油、脫氧膽酸、丁酸鹽、酵母聚糖。④結(jié)直腸擴(kuò)張法。結(jié)直腸擴(kuò)張是一種局部機(jī)械性刺激，此法是實驗室和臨床評估腸道感覺時使用最廣泛的刺激方法[4]。⑤過敏刺激法。⑥除了以上模擬發(fā)病危險因素所用的造模方法以外，還有腦室內(nèi)注射神經(jīng)遞質(zhì)致敏、腦腸相互作用定向應(yīng)激、腹腔注射前體致敏、腹腔注射抗生素導(dǎo)致細(xì)菌潛生體定植、基因敲除等，但這些方法并沒有被廣泛應(yīng)用。

2 “證”模型的建立方法

中國古代醫(yī)學(xué)中無“腸易激綜合征”這一病名。根據(jù)IBS-D的主要臨床癥狀可將其歸屬于“泄瀉”“腹痛”等范疇。近年亦有學(xué)者將其歸為“郁證”范疇[5]。劉康毅[6]從知網(wǎng)、維普、萬方等數(shù)據(jù)庫收集了近十五年與IBS-D相關(guān)的文獻(xiàn)(1 189篇)，通過嚴(yán)格篩選從中提取IBS-D中醫(yī)相關(guān)證候要素、證型等，發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛是出現(xiàn)頻次最高的證型。 肝郁脾虛證屬于中醫(yī)傳統(tǒng)證候，造模方法也需以傳統(tǒng)中醫(yī)的病因病機(jī)理論為依據(jù)。肝郁脾虛多因情志失調(diào)、憂思惱怒而橫逆乘脾,脾失健運(yùn),脾氣漸虛。一般認(rèn)為，肝郁脾虛時，機(jī)體存在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)失調(diào)、腦腸軸異常、腦電生理功能紊亂[7]。這與IBS-D的西醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)制中腦-腸軸調(diào)節(jié)異常相吻合。

石亮[8]發(fā)現(xiàn)目前肝郁脾虛證的動物模型主要有3類：①藥物造模法。通過大量藥物如艾葉煎液、腎上腺素、CCl4等皮下大量注射造成急、慢性中毒性肝損傷。②情志刺激法。通過頸部帶枷喂養(yǎng)法、捆綁法或夾尾激怒打斗法等改變動物的生理狀態(tài)。③藥物合情志刺激法結(jié)合。通過翻閱文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)學(xué)者普遍認(rèn)為藥物造模法會一定程度上造成肝臟急、慢性的實質(zhì)性損傷，但肝郁不能等同于肝損傷。綜上可以認(rèn)為，情志刺激造模法更加符合中醫(yī)傳統(tǒng)理論。

3 疾病模型特征與“證”模型特征的評價

3.1 IBS-D疾病模型特征的評價

從目前的動物模型來看，主要圍繞病理生理特征進(jìn)行研究。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IBS-D并非單因素導(dǎo)致,是多種因素共同作用的結(jié)果。內(nèi)臟敏感性增高、胃腸動力學(xué)異常、腦-腸軸調(diào)節(jié)異常、精神心理障礙、腸道感染及免疫功能紊亂、腸道微生態(tài)失衡、飲食及遺傳因素等與該病的發(fā)生過程密切相關(guān)[9]。已知其病理生理學(xué)基礎(chǔ)主要是胃腸動力、內(nèi)臟感知異常[1],那么IBS-D大鼠模型的建立可以以此作為評價標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合腸神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)觀察。

3.1.1 內(nèi)臟敏感性評價

張北華[3]總結(jié)出近年來國內(nèi)內(nèi)臟敏感性評價中最為常用的主要有以下幾項：①腹部回縮反射。通過肉眼觀察腹部的反應(yīng)，可間接反應(yīng)內(nèi)臟運(yùn)動的反射。②腹壁肌電活動。此是動物實驗中衡量內(nèi)臟敏感性最常應(yīng)用的方法，指標(biāo)客觀，且操作相對簡單。③神經(jīng)元細(xì)胞的電生理。此是將微電級插入分離出的相應(yīng)脊髓節(jié)段的單個神經(jīng)元細(xì)胞，具有創(chuàng)傷性，對操作技術(shù)和設(shè)備的要求較高，因此一定程度上限制了該法的廣泛運(yùn)用。④離體腸管神經(jīng)肌肉的收縮反應(yīng)。

3.1.2 胃腸動力評價

采用胃排空小腸推進(jìn)率測定法、胃腸道腔外電橋式應(yīng)力傳感器記錄法、胃腸激素(胃泌素、胃動素、生長抑素等)測定、免疫組織化學(xué)方法、離體體胃腸平滑肌肌條動力測定、胃腸內(nèi)壓描記法[9]。

3.1.3 神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)評價

黃辰等[10]從文獻(xiàn)檢索中得出用于評價IBS-D動物造模的常用指標(biāo)有胃泌素、胃動素；趙梁等[11]通過觀察發(fā)現(xiàn)生長抑素 和血管活性腸肽、 5-羥色胺等腦腸肽含量有明顯變化。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),5-羥色胺、P物質(zhì)、血管活性腸肽、生長抑素、一氧化氮等在腸易激綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究最多。由于目前還沒有統(tǒng)一的組織學(xué)評價指標(biāo)，尚將此作為IBS-D動物造模的評價指標(biāo)。

3.1.4 腹瀉的評價

國內(nèi)外研究評價腹瀉主要從大便的含水量、評分，腹瀉的潛伏期，腹瀉率，稀便率，稀便級，腹瀉指數(shù)和體質(zhì)量增長率幾個方面進(jìn)行[12]。

3.2 肝郁脾虛型特征的評價

3.2.1 肝郁評價方法

肝郁脾虛證患者除了腹痛、腹瀉的癥狀外，還有急躁易怒或情志抑郁、善太息癥狀，多因情志因素誘發(fā)或加重。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝郁多由情志不暢所致，日久犯脾而致脾虛。因此對中醫(yī)肝郁證動物模型的評價多借鑒抑郁癥的評價方法，常用的評價方法[3]有以下幾個方面：①一般狀態(tài)觀察。通過大鼠皮毛變化、對外界刺激的反應(yīng)、精神狀態(tài)情況等來評價。②糖水偏好[10]。依據(jù)嚙齒類動物喜嗜甜味溶液這一特點(diǎn)，用糖水作為獎賞，應(yīng)激前后糖水偏好系數(shù)可作為評價大鼠快感缺失的重要方法，糖水偏好降低是抑郁大鼠的核心癥狀。③高架十字迷宮[10]。此是國際上公認(rèn)評估焦慮行為的方法，利用大鼠對于新事物的好奇、高懸開放環(huán)境的恐懼和天生對黑暗環(huán)境的傾向。④曠場實驗[10]。常以此用來評價肝郁脾虛動物造模期間的精神狀態(tài)。⑤強(qiáng)迫游泳[10]。此是將大鼠被迫放在一個無法逃脫的游泳環(huán)境中，先出現(xiàn)游泳掙扎試圖逃脫，后絕望轉(zhuǎn)而放棄游泳。⑥懸尾實驗[10]。將大鼠尾尖向上懸掛于固定裝置上，大鼠為了擺脫這種不舒服體位出現(xiàn)掙扎，一段時間后主動放棄掙扎。

3.2.2 脾虛評價方法

脾虛證患者多表現(xiàn)為納差食少，大便溏，體質(zhì)量下降。通過觀察各組大鼠體質(zhì)量、大便和造模后進(jìn)食量來評價其脾虛情況。

4 IBS-D大鼠模型肝郁脾虛的造模方法

4.1 乙酸灌腸刺激

李燕舞等[13]以乙酸每天1次、連續(xù)2周灌腸來建立 IBS-D 內(nèi)臟高敏大鼠模型，并與母子分離(從出生后第2天開始母子分離，每天3 h)2周建立的模型做對照。以大鼠腹部回縮反射( AWR) 評估腸道敏感性來評價疾?。槐芩畱?yīng)激實驗觀察其排便數(shù)量對腸道運(yùn)動進(jìn)行評估腹瀉癥狀的建立。結(jié)果：兩種方法均可造成大鼠內(nèi)臟高敏模型，但母子分離模型能更好地模擬IBS 腹痛及排便異常癥狀。遺憾的是該實驗未對肝郁脾虛證型的建立進(jìn)行評估。

4.2 母嬰分離+乙酸刺激+束縛應(yīng)激

柴玉娜等[14]按照文獻(xiàn)方法采用母嬰分離+乙酸刺激+束縛應(yīng)激制備肝郁脾虛模型大鼠。造模結(jié)束后,用腹部回縮反射方法評估腸道敏感性;從進(jìn)食量、糖水偏好率、自主活動情況進(jìn)行行為學(xué)評分，以對肝郁脾虛證型的建立進(jìn)行評估。該實驗未對腸道動力及腹瀉情況進(jìn)行評估，此法能否建立穩(wěn)定的IBS 療效機(jī)制的動物模型，但仍需要進(jìn)一步的研究。

4.3 醋酸灌腸+夾尾刺激法

劉啟泉等[15]采用 1 mL 1%醋酸灌腸結(jié)合改良夾尾刺激 3周綜合造模。每周 3 次，每次 30 min，期間同時對大鼠施行強(qiáng)光刺激、敲打鼠籠等以減少大鼠休息時間。造模過程中觀察大鼠糞便情況，超過 25%的稀便、少于 25%質(zhì)地堅硬糞便即為造模成功。通過觀察大鼠皮毛變化、精神狀態(tài)、稀便程度確立證型，觀察大鼠糞便情況評價腹瀉情況和肝郁脾虛的確立。鏡下觀察結(jié)腸組織，檢驗?zāi)c道變化建立疾病，通過造模前后IL-1β、P物質(zhì)、5-羥色胺含量的變化評價疾病的建立。此法的評價指標(biāo)簡單，但能否再次復(fù)制仍需要進(jìn)一步的研究。

4.4 饑飽失常+番瀉葉灌胃+強(qiáng)迫游泳

郭紅[16]在使用腸激寧方治療肝郁脾虛證IBS-D的實驗中采用饑飽失常+番瀉葉灌胃+強(qiáng)迫游泳2周的方法造模，復(fù)制肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型。以大鼠抬腹壓力閾值、拱背壓力閾值來評估大鼠結(jié)腸敏感度，以大鼠的大體情況、糞便含水量、稀便級數(shù)、稀便率評估腹瀉癥狀的建立配合炭末推進(jìn)率評估腸道動力，以兩者確立疾?。灰蕴撬弥笖?shù)、曠場實驗、大鼠體質(zhì)量變化評估肝郁脾虛證型。此法采用多種實驗評價方法驗證，可靠性強(qiáng)，但文獻(xiàn)中并無具體操作方法，實驗復(fù)制難度大。

4.5 新生母子分離 + 慢性束縛 +番瀉葉灌胃法

趙迎盼等[17]研究了IBS-D肝郁脾虛型病證癥結(jié)合大鼠模型的建立。采用新生母子分離 2周+慢性束縛3 周+番瀉葉灌胃1周法成功復(fù)制了該模型，并進(jìn)行高、中、低劑量組實驗，確定番瀉葉灌胃 0. 45 g /m L、1 m L/100 g效果最佳。造模后以結(jié)直腸擴(kuò)張的疼痛閾值代表內(nèi)臟敏感性以評價疾病，以曠場實驗和血清D-木糖水平評價肝郁脾虛證型的建立;以排便粒數(shù)和稀便率評價腹瀉癥狀的建立。該研究認(rèn)為此三因素復(fù)合 SD 模型大鼠符合 IBS-D 肝郁脾虛型疾病特點(diǎn)，可能是一種較好的研究中醫(yī)藥治療 IBS 療效機(jī)制的動物模型。

張北華等[18]通過對幾種造模方法進(jìn)行動物實驗對比研究表明：采用母子分離 8 周+慢性束縛應(yīng)激3周+番瀉葉灌胃1周，番瀉葉煎劑( 0. 45 g/mL)灌胃( 4. 5 g/kg) 可成功建立肝郁脾虛型病證結(jié)合大鼠模型；采用慢性束縛聯(lián)合母子分離法造模優(yōu)于單一因素法；內(nèi)臟敏感性評價疾病、大便積分評價腹瀉癥狀的建立、曠場行為學(xué)評價肝郁脾虛證型的建立。該研究所建立的肝郁脾虛型大鼠模型具有內(nèi)臟高敏感性、腸道通透性增加、抑郁和免疫功能異常等多種特征。

周云等[19]以番瀉葉水煎劑灌胃+四肢慢性束縛應(yīng)激刺激每天1次、連續(xù)6 d的方法建立肝郁脾虛型IBS 大鼠模型，觀察大鼠的一般情況如體質(zhì)量、糞便含水量、稀便級數(shù)評價腹瀉癥狀的建立及肝郁脾虛模型的建立，小腸炭末推進(jìn)百分率評估腸道動力，血清中 5-羥色胺含量變化評價疾病的建立，大鼠模型結(jié)腸黏膜組織無明顯病理改變符合功能性腸病的改變。此法建立的肝郁脾虛型大鼠模型評價指標(biāo)簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，但未對腸道敏感性進(jìn)行評價，是否能作為穩(wěn)定的IBS 療效機(jī)制的動物模型，仍需要進(jìn)一步的研究。

5 討 論

IBS-D肝郁脾虛型大鼠模型是一種具有肝郁和脾虛兩種證候特點(diǎn)、以腹瀉為主癥的一種非器質(zhì)性疾病模型。通過查閱文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)由于精神心理因素在發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。在實踐中，心理應(yīng)激(慢性束縛應(yīng)激)聯(lián)合夾尾刺激、番瀉葉灌胃或乙酸灌腸是最常采用的造模方法，符合中醫(yī)情志致病的理論：肝郁久犯脾，可導(dǎo)致脾虛。新生期母子分離作為情志刺激，也可導(dǎo)致肝郁。番瀉葉一般被認(rèn)為是苦寒瀉下脾虛造模的首選，可致腹瀉，是中醫(yī)脾虛證的一個致病因素。因此,慢性束縛應(yīng)激、夾尾刺激不僅可使大鼠內(nèi)臟敏感性增高又是肝郁證造模的方法。本研究的目的即是尋找出一種最接近肝郁脾虛證本質(zhì)的穩(wěn)定的可重復(fù)的造模方法。

目前對 IBS-D 動物模型的造模方法尚未成熟，建立IBS-D 肝郁脾虛型病證結(jié)合動物模型的研究中依舊存在一些問題。值得一提的是，利用西醫(yī)疾病模型與中醫(yī)證候特點(diǎn)的單純疊加，可以更好地模擬 IBS-D 的病理特點(diǎn)。現(xiàn)有的病證結(jié)合動物模型造模方法分析，多采用束縛應(yīng)激法模擬疾病特征，這種方法作用短暫，模型穩(wěn)定性欠佳；建立證候模型所用造模方法缺乏公認(rèn)性和普適性。通過大量的研究,需要對上述問題進(jìn)行驗證和改進(jìn),使 IBS-D 肝郁脾虛證與動物模型結(jié)合起來更加成熟,充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢。沒有明確的標(biāo)準(zhǔn),就沒有合格的模型產(chǎn)品，因此在實踐中,應(yīng)不斷摸索和完善病證結(jié)合動物模型的統(tǒng)一的評價方法。根據(jù)腸易激綜合征的發(fā)病機(jī)制,對動物模型的研究尚處于探索階段，全面深入地研究其發(fā)病機(jī)制對該證型造模方法具有重要意義。同時,肝郁脾虛證動物模型有助于研究該證型復(fù)方的作用機(jī)理,驗證復(fù)方的功效，進(jìn)新藥開發(fā),充分發(fā)揮中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢。