腫瘤大基因包高通量測(cè)序在臨床中的應(yīng)用進(jìn)展

近年來，隨著基因組學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)已從組織水平深入到分子水平，越來越多的腫瘤分子標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，在臨床上基于各種分子標(biāo)記物的靶向治療和免疫治療表現(xiàn)出極大的抗腫瘤活性，引領(lǐng)了腫瘤治療領(lǐng)域的重大突破。以高通量測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的分子診斷愈發(fā)重要，因此本文就大基因包（panel）高通量測(cè)序在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用進(jìn)行分析，探討其如何應(yīng)用于臨床并指導(dǎo)臨床診療。

1 高通量測(cè)序panel的分類

高通量測(cè)序的panel多種多樣，從panel所涵蓋的基因數(shù)目來看，大致可以分為小panel、中panel和大panel。小panel常涵蓋幾個(gè)至幾十個(gè)基因，主要根據(jù)相應(yīng)治療指南中藥物的推薦，針對(duì)某一癌種的檢測(cè)，檢測(cè)與實(shí)際靶向用藥直接相關(guān)，以指導(dǎo)患者的治療。中panel常針對(duì)與腫瘤相關(guān)的幾十個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，其涵蓋美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）/中國國家藥品監(jiān)督管理局（Na?tional Medical Products Administration，NMPA）等批準(zhǔn)的多癌種靶向藥物的靶點(diǎn)，甚至包含臨床試驗(yàn)相關(guān)靶向藥物的靶點(diǎn)等，為多癌種的靶向治療提供參考。大panel常涵蓋幾百個(gè)基因，涉及已批準(zhǔn)靶向藥物的基因位點(diǎn)，臨床實(shí)驗(yàn)藥物相關(guān)的基因位點(diǎn)，腫瘤信號(hào)通路相關(guān)基因位點(diǎn)、耐藥基因位點(diǎn)、罕見基因等，此外大panel可評(píng)估患者腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）的水平進(jìn)而預(yù)測(cè)免疫治療的療效。2018年7月至11月，中國NMPA批準(zhǔn)4款高通量檢測(cè)的三類醫(yī)療器械產(chǎn)品上市，均為小panel試劑盒，針對(duì)性和實(shí)用性皆強(qiáng)。2017年年底，F(xiàn)DA審批通過2個(gè)基于大panel的基因檢測(cè)分析平臺(tái)，對(duì)整個(gè)精準(zhǔn)醫(yī)療產(chǎn)生巨大影響。2017年11月15日，美國FDA正式批準(zhǔn)紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥研究中心的癌癥基因檢測(cè)分析平臺(tái)MSK-IMPACTTM用于癌癥患者468個(gè)基因檢測(cè)，主要用于檢測(cè)點(diǎn)突變（single-nucleotide variant，SNV）、插入缺失（insertion/deletion，InDel）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），但不用于伴隨診斷，亦未注明檢測(cè)TMB。2017年11月30日，美國FDA跟醫(yī)療保險(xiǎn)和醫(yī)療補(bǔ)助服務(wù)中心（CMS）同時(shí)批準(zhǔn)Foundation Medicine公司旗下產(chǎn)品FoundationOne CDx（F1CDx）用于泛癌種臨床伴隨診斷，這是首款突破性的基于高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation se?quencing，NGS）的體外伴隨診斷產(chǎn)品，針對(duì)324個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，包括SNV、InDel、拷貝數(shù)變異（copy num?ber variation、CNV）、結(jié)構(gòu)變異（structure variation，SV）、MSI、TMB，MSI和 TMB作為分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。提示基于NGS方法檢測(cè)腫瘤組織TMB正式被認(rèn)可。

2 大panel在腫瘤臨床中的應(yīng)用

2.1 大panel在腫瘤診斷中的應(yīng)用

在分子分型上，大panel可以對(duì)原發(fā)灶不明（can?cer of unknown primary，CUP）腫瘤的分析提供依據(jù)。Rekhtman等［1］使用MSK-IMPACT對(duì)肺大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同的基因突變特征可以將其細(xì)分為2種大亞型和1種小亞型：小細(xì)胞樣，攜帶TP53+RB1共突變/缺失和其他小細(xì)胞型的基因改變，如MYCL基因擴(kuò)增；非小細(xì)胞樣，缺少TP53+RB1共同改變以及常在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中發(fā)生的基因突變（STK11，KRAS，KEAP1）；肉瘤樣，攜帶MEN1突變和低的突變負(fù)荷。3種亞型具有明顯不同的基因特征，而且小細(xì)胞樣和非小細(xì)胞樣患者具有不同的臨床病理特征。

此外，對(duì)于CUP腫瘤臨床醫(yī)生往往很難進(jìn)行治療決策，Ross等［2］使用 FoundationOne的研究發(fā)現(xiàn)，96%患者至少檢測(cè)到1個(gè)基因變異，平均每位患者檢測(cè)到4個(gè)基因變異，許多基因變異均有對(duì)應(yīng)的抗腫瘤藥物，如厄洛替尼、克唑替尼和維莫菲尼，或在進(jìn)行臨床研究的藥物，多達(dá)85%患者可獲得臨床干預(yù)的機(jī)會(huì)，大大提高了CUP患者的治療可能性。

最后，大panel可以提供預(yù)后相關(guān)信息，Bielski等［3］使用MSK-IMPACT測(cè)序平臺(tái)對(duì)9 692例晚期癌癥患者（含55種腫瘤類型）的腫瘤樣本和血液配對(duì)樣本進(jìn)行靶向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)近30%腫瘤患者中存在全基因組倍增（whole-genome doubling，WGD），是與癌癥類型預(yù)后不良相關(guān)的宏觀進(jìn)化事件相關(guān)，是患者預(yù)后有效的提示。

2.2 大panel在腫瘤治療中的應(yīng)用

2.2.1 大panel在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用 在靶向治療方面，大panel涵蓋的腫瘤相關(guān)基因越多，患者有可能接受靶點(diǎn)干預(yù)的可能性越高，特別是對(duì)于攜帶罕見基因突變以及耐藥基因突變的患者，由于受中小panel NGS或其他基因檢測(cè)方法涵蓋的基因位點(diǎn)數(shù)量限制，部分患者可能會(huì)漏檢。在Rozenblum等［4］使用FoundationOne和Guardant360的NGS方法進(jìn)行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，42.6%患者的治療方案發(fā)生改變，客觀緩解率（objective response rate，ORR）為65%，且在常規(guī)EGFR/ALK的分子檢測(cè)陰性患者中，17.4%（15/86）患者EGFR/ALK檢測(cè)到存在變異。2018年11月26日，美國FDA加速批準(zhǔn)了TRK抑制劑拉羅替尼（larotrectinib，vitrakvi）用于治療攜帶NTRK基因融合的晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的成人和兒童患者，是獲批的第一個(gè)與腫瘤發(fā)生位置無關(guān)的廣譜抗癌靶向藥。在常見腫瘤類型中，攜帶這一融合基因的患者比例較低，而攜帶罕見突變的患者將受益于大panel檢測(cè)，可獲得新藥治療的機(jī)會(huì)。

與外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）相比，大panel檢測(cè)同樣展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，可提高突變檢出率，Zehir等［5］使用MSK-IMPACT對(duì)10 000例患者進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，至少有9%的癌癥相關(guān)突變WES未檢測(cè)到，一些融合基因WES亦未檢測(cè)到。對(duì)于一些重要的非編碼區(qū)域，如TERT基因的啟動(dòng)子區(qū)域WES常常不覆蓋，而基于MSK-IMPACT的研究表明在黑色素瘤、尿路上皮癌和甲狀腺乳頭狀癌中，攜帶TERT基因啟動(dòng)子區(qū)域突變患者的生存率明顯低于未突變的患者。研究人員發(fā)現(xiàn)，在10 000例患者中，36.7%患者攜帶至少1種可用MSK-IMPACT檢測(cè)到的突變，提示可入組至相關(guān)靶向藥物的臨床試驗(yàn)。在此研究中，11%的患者均參與了不同靶向藥物的臨床試驗(yàn)。

大panel在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用充分體現(xiàn)了傘式研究（umbrella trial，同時(shí)完成不同的藥物相關(guān)靶點(diǎn)的檢測(cè)，根據(jù)不同的靶基因給予不同的精準(zhǔn)靶向藥物）和籃式研究（basket trial，一種藥物應(yīng)對(duì)不同的腫瘤類型）的精髓，加速促進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)治療的發(fā)展［6］。

2.2.2 大panel在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用 大panel可以通過評(píng)估TMB來預(yù)測(cè)免疫治療的療效。TMB定義為基因組中每1 Mb蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS）的平均突變個(gè)數(shù)［TMB=CDS區(qū)域內(nèi)體細(xì)胞突變的數(shù)量/CDS區(qū)域的長(zhǎng)度（MB）］，最好的方案是對(duì)腫瘤進(jìn)行WES以準(zhǔn)確計(jì)算TMB。但因腫瘤異質(zhì)性等原因，腫瘤體細(xì)胞測(cè)序?qū)y(cè)序深度要求較高，常常在500×以上，而常規(guī)的全外顯子測(cè)序深度低，高深度的WES成本非常高，具有較多的臨床應(yīng)用限制。研究表明，大panel與WES的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較高，可用來替代全外顯子測(cè)序來計(jì)算TMB［7-10］。Panel所涵蓋的基因與腫瘤的關(guān)聯(lián)性，基因數(shù)量、檢測(cè)區(qū)域、CDS區(qū)域大小均對(duì)TMB具有重要影響，一般大panel的基因數(shù)量建議在300個(gè)以上［10］，CDS區(qū)域在1.5～3.0 Mb之間［9］。對(duì)于免疫治療，大panel除了可以用來評(píng)估TMB外，通常還涉及MSI和DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）相關(guān)基因的評(píng)估，大panel高通量檢測(cè)逐漸獲得臨床應(yīng)用推廣。

Yarchoan等［11］曾報(bào)道，在27種腫瘤類型/亞型中，TMB和接受程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）及其配體（PD-L1）抑制劑的免疫治療后ORR具有明顯的線性相關(guān)性，TMB越大，PD-1抑制劑有效率越高。不同患者接受PD-1抑制劑治療有效率差別大，其中55%的差異可以通過TMB高低來解釋。TMB越高，癌細(xì)胞產(chǎn)生的新抗原越多，腫瘤免疫原性越強(qiáng)，被免疫細(xì)胞識(shí)別的可能性更高，越適合免疫治療，患者從免疫治療中獲益越多。Goodman等［12］的研究使用FoundationOne方法對(duì)1 638例患者TMB進(jìn)行評(píng)估，其中151例接受過PD-1抑制劑治療。根據(jù)TMB分成高、中、低3組，相比TMB中或低的兩組患者，TMB高的患者有效率（response rate，RR）（58%vs.20%）、無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）（12.8個(gè)月vs.3.3個(gè)月）、總生存期（over?all survival，OS）（未達(dá)到vs.16.3個(gè)月），均明顯提高。Carbone等［13］報(bào)道Checkmate-026的研究證實(shí)高水平TMB免疫治療有效性增加：高TMB亞組（≥243個(gè)突變）納武單抗的ORR較化療明顯提高（47%vs.28%）且PFS明顯延長(zhǎng)（9.7個(gè)月vs.5.8個(gè)月）。此外，Hell?mann等［14］報(bào)道以TMB作為篩選標(biāo)準(zhǔn)（TMB高于10個(gè)突變/Mb）的三期臨床試驗(yàn)Checkmate-227（NCT02477826）取得成功。在TMB高于10個(gè)突變/Mb的晚期NSCLC中，PD-1抗體納武單抗（nivolum?ab，opdivo）聯(lián)合伊匹單抗（ipilimumab，yervoy），一線治療戰(zhàn)勝了鉑類雙聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)方案化療，納武單抗加低劑量伊匹單抗治療明顯延長(zhǎng)了1年的PFS率（42.6%vs.13.2%），PFS也顯著延長(zhǎng)（7.2個(gè)月vs.5.4個(gè)月）。該研究結(jié)果是在全球范圍內(nèi)首次在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中證實(shí)：無論P(yáng)D-L1表達(dá)水平如何，NSCLC患者通過FoundationOne CDx（F1CDX）大panel的檢測(cè)評(píng)估為高TMB，聯(lián)合免疫治療能夠使這部分患者PFS顯著獲益。同時(shí)，臨床試驗(yàn)CheckMate-568（NCT02659059）結(jié)果也表明，在接受納武單抗聯(lián)合伊匹單抗治療的NSCLC患者，無論P(yáng)D-L1表達(dá)水平如何，TMB≥10個(gè)突變/Mb患者中位PFS幾乎為TMB＜10個(gè)突變/Mb患者的3倍（7.1個(gè)月vs.2.6個(gè)月）。CheckMate-227和CheckMate-568奠定了基于大panel評(píng)估TMB的臨床應(yīng)用價(jià)值。TMB的應(yīng)用可以有效鑒別真正能夠得到免疫治療臨床獲益的患者，可以作為獨(dú)立可靠的免疫治療預(yù)測(cè)標(biāo)志物。2018年10月，美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）發(fā)布了NSCLC指南2019年（第1版），該版本首次將TMB納入其中，用于識(shí)別適合接受“納武單抗+伊匹單抗”雙藥聯(lián)合免疫治療和“納武單抗”單藥免疫治療的肺癌患者。

免疫治療在實(shí)體瘤的臨床治療中取得重大突破，已成為腫瘤患者最有效的治療方法之一。但在未經(jīng)篩選的患者中，免疫治療單藥有效率偏低約為20%。基于大panel的TMB、MSI等分子標(biāo)志物可篩選出免疫治療獲益人群，而Gainor等［15］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶EGFR或ALK明確基因突變的患者免疫治療ORR顯著較低。Rizvi等［7］使用MSK-IMPACT也觀察到在接受PD-1/PD-L1抑制劑治療的NSCLC中，和無持久獲益（no durable benefit，NDB）的患者相比，6個(gè)月以上臨床獲益（部分緩解/穩(wěn)定）（durable clinical benefit，DCB）的患者中TMB高，且PFS更長(zhǎng)；而在EGFR和STK11突變的患者中免疫治療療效欠佳。Offin等［16］使用MSK-IMPACT對(duì)已經(jīng)服用一、二代酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）藥物EGFR突變患者的研究發(fā)現(xiàn)，高TMB患者的治療停止時(shí)間（timeto-treatment discontinuation，TTD）和OS明顯縮短，隨訪發(fā)現(xiàn)，患者出現(xiàn)TKI耐藥時(shí)，TMB明顯增加。這也就意味著TMB是接受EGFR-TKI治療的轉(zhuǎn)移性EG?FR突變肺癌患者臨床預(yù)后的負(fù)性因子。因此，大panel評(píng)估TMB可以同時(shí)考量對(duì)影響免疫治療療效驅(qū)動(dòng)基因的變異狀態(tài)。

除了MSK-IMPACT和F1CDx兩個(gè)大panel外，包括Illumina在內(nèi)的多家平臺(tái)都開發(fā)了腫瘤相關(guān)的大panel用于TMB評(píng)估［9］，臨床應(yīng)用的意義尚需進(jìn)一步評(píng)估。

TMB評(píng)估目前主要是基于腫瘤組織的檢測(cè)，而部分患者無足夠或無法活檢到腫瘤組織［17］。而在POPLAR（NCT01903993）和OAK（NCT02008227）兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，評(píng)估基于大panel的血液腫瘤突變負(fù)荷（blood TMB，bTMB）對(duì)于免疫治療藥物療效預(yù)測(cè)仍具有有效性，對(duì)于組織腫瘤突變負(fù)荷（tissue TMB，tTMB）高的人群均能夠從免疫治療中獲益［18］。該結(jié)果提示bTMB能夠作為免疫治療的潛在無創(chuàng)生物標(biāo)志物。

2.3 大Panel臨床應(yīng)用中遇到的問題

隨著腫瘤靶向治療和免疫治療的迅速發(fā)展，腫瘤分子診斷已成為高通量測(cè)序醫(yī)療應(yīng)用領(lǐng)域的爆發(fā)性增長(zhǎng)點(diǎn)。大panel在臨床應(yīng)用中仍要面對(duì)諸多挑戰(zhàn)。首先，使用大panel評(píng)估TMB是衡量免疫治療的重要方法之一，但在不同的大panel研究中涉及到基因不同，篩選計(jì)算TMB的體細(xì)胞突變條件也不相同。在FoundationOne的方法中，篩選出編碼區(qū)域體細(xì)胞SNV/Indel包含同義突變用于計(jì)算TMB，但不包含Cosmic數(shù)據(jù)庫中記錄的突變也不包含抑癌基因的截?cái)嗤蛔儯?9］。在基于MSK-IMPACT一項(xiàng)結(jié)直腸癌相關(guān)的研究中，計(jì)算TMB的位點(diǎn)為編碼區(qū)域體細(xì)胞SNV/Indel但不包含同義突變［20］。大 panel評(píng)估TMB需與WES評(píng)估TMB進(jìn)行一致性比對(duì)，以WES為基準(zhǔn)，規(guī)范大panel評(píng)估TMB的評(píng)價(jià)體系。目前，不同的TMB計(jì)算方法孰優(yōu)孰劣，尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。2018年10月，NCCN發(fā)布的2019年（第1版）NSCLC指南首次將TMB納入其中，用于識(shí)別適合接受免疫治療的肺癌患者，但對(duì)于如何衡量TMB，目前尚未達(dá)成共識(shí)，亟需積累更多的數(shù)據(jù)以促進(jìn)評(píng)估TMB方法的規(guī)范化。

其次，在大panel的數(shù)據(jù)解讀中，通過大panel的檢測(cè)，可以獲得更多基因位點(diǎn)信息，同樣也會(huì)獲得大量意義不明的變異（variants of uncertain significance，VUS），其臨床意義不明，但也可能在其他癌種中具有潛在治療價(jià)值［21］。實(shí)驗(yàn)室和臨床之間的連接不易，公共數(shù)據(jù)庫中變異位點(diǎn)的信息，如獲得的對(duì)蛋白質(zhì)的功能影響和對(duì)治療反應(yīng)的信息，有助于變異的解讀。越來越多的高通量VUS功能評(píng)估出現(xiàn)，對(duì)于大量VUS功能的解讀會(huì)有快速提升［22-23］。在解讀中，對(duì)于VUS的管理，針對(duì)變異位點(diǎn)的綜合分析至關(guān)重要。對(duì)于腫瘤患者進(jìn)行檢測(cè)，特別是大panel檢測(cè)之前，建議患者進(jìn)行遺傳咨詢，知情檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)的多種可能性，以及對(duì)未來疾病管理的建議和家庭計(jì)劃生育的選擇［24］。

最后，在使用大panel檢測(cè)的整個(gè)過程中，從接收臨床樣本到出具完整的報(bào)告，從濕實(shí)驗(yàn)到干實(shí)驗(yàn)，質(zhì)量評(píng)估和控制也是重要問題，需要進(jìn)一步摸索與規(guī)范。最后，高通量測(cè)序大panel在臨床研究中證實(shí)了其臨床可用性，而在實(shí)驗(yàn)性能確認(rèn)和臨床驗(yàn)證中要面對(duì)下述多方面的問題；1）大panel中涉及上百個(gè)基因的突變位點(diǎn)，如何在性能確認(rèn)中將panel所覆蓋范圍內(nèi)的所有位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估，如果進(jìn)行選擇性基因突變位點(diǎn)的性能評(píng)估，如何做到所選擇評(píng)估的范圍和基因可以完整體現(xiàn)整個(gè)大panel的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)；2）大panel中涉及罕見的基因變異位點(diǎn)，如何在臨床驗(yàn)證中對(duì)罕見變異進(jìn)行評(píng)估；3）對(duì)于無熱點(diǎn)突變的基因，如何在實(shí)驗(yàn)性能確認(rèn)和臨床驗(yàn)證做到有效評(píng)估。在上述方面，明確大panel試劑預(yù)期用途的前提下，針對(duì)試劑的精密度、準(zhǔn)確性、檢測(cè)下限和分析特異性，對(duì)重要常見基因的檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估，對(duì)不同變異類型的檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估，并且對(duì)高度重復(fù)區(qū)域，GC含量高的區(qū)域進(jìn)行評(píng)估。和小panel產(chǎn)品相比，大panel產(chǎn)品在性能確認(rèn)和臨床驗(yàn)證方面，更需明確其預(yù)期用途，與藥物臨床試驗(yàn)相結(jié)合共同推進(jìn)為有效規(guī)范的途徑之一。

3 展望

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的推進(jìn)和大數(shù)據(jù)處理分析水平的提升，高通量測(cè)序從科研應(yīng)用走向臨床應(yīng)用，涵蓋幾百個(gè)基因的大panel高通量檢測(cè)逐漸獲得了臨床應(yīng)用推廣，而大panel信息量大，需要有效的性能確認(rèn)，合理的質(zhì)量控制，以及強(qiáng)大的生物信息支撐和全面的臨床配套，應(yīng)逐漸規(guī)范大panel的使用，推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)步。