冷凍消融聯(lián)合免疫治療實(shí)體腫瘤研究進(jìn)展

孟亮亮，張 肖，張嘯波，吳 斌，李 競(jìng)，何曉鋒，魏穎恬，張 欣，肖越勇*

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院放射診斷科，北京 100853；2.武警北京市總隊(duì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，北京 100027)

治療實(shí)體腫瘤的首選方法是外科手術(shù)切除，但較大比例患者確診時(shí)已無(wú)手術(shù)指征，且手術(shù)對(duì)人體免疫防御系統(tǒng)損傷顯著。CT或MRI引導(dǎo)下冷凍消融具有創(chuàng)傷性小、并發(fā)癥少、導(dǎo)向精準(zhǔn)、療效顯著、恢復(fù)迅速等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于臨床治療腫瘤[1]。冷凍消融不僅能使腫瘤組織壞死和凋亡，還可促進(jìn)腫瘤來(lái)源自身抗原釋放至血液循環(huán)中，刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的良好抗腫瘤免疫效應(yīng)，導(dǎo)致原發(fā)腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶消退，這種附加效應(yīng)被稱(chēng)為“伴隨效應(yīng)”，被認(rèn)為是與免疫治療產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用的基礎(chǔ)[2]。腫瘤免疫治療利用抗原、抗體、疫苗、細(xì)胞或病毒等使機(jī)體產(chǎn)生或增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達(dá)到控制甚至消滅腫瘤的目的。本文圍繞冷凍消融所致免疫效應(yīng)和腫瘤免疫聯(lián)合治療腫瘤的效果與機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 冷凍消融所致免疫功能改變

冷凍消融滅活腫瘤主要通過(guò)以下途徑，即細(xì)胞外結(jié)冰導(dǎo)致溶液效應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、微血管內(nèi)血栓形成及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]?？拷鋬鎏结樀慕M織冷凍速率高，溫度低至足以引起細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞器破壞、細(xì)胞膜破裂，使細(xì)胞即刻死亡；遠(yuǎn)離冷凍探針的腫瘤細(xì)胞所受冷凍損傷程度不及鄰近探針者，但當(dāng)冷凍程度達(dá)到細(xì)胞不可逆損傷時(shí)則發(fā)生凋亡；距離冷凍探針更遠(yuǎn)的細(xì)胞僅產(chǎn)生可逆性?xún)鰝?。?duì)組織的即刻解凍會(huì)使液體進(jìn)入受損的細(xì)胞膜，導(dǎo)致其破裂，再結(jié)晶過(guò)程產(chǎn)生的剪切力亦會(huì)進(jìn)一步損傷組織[5]。冷凍消融引起的機(jī)體免疫功能改變既有刺激性變化，也有抑制性變化。

1.1 冷凍消融引起的免疫刺激 與傳統(tǒng)放射治療相比，冷凍消融的不良反應(yīng)較少，并能促進(jìn)更全面、更有效地自體抗原釋放到循環(huán)中[6-7]。冷凍消融導(dǎo)致的壞死腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身吸收后形成大量腫瘤特異性自身抗原，釋放到血液循環(huán)，由主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)分子(major histocompatibility complex class Ⅰ, MHC-Ⅰ)處理并遞呈，激活細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用，進(jìn)而使消融后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)區(qū)殘留病灶消失[2，8]。Sabel等[9]利用腫瘤再挑戰(zhàn)模型對(duì)小鼠MT-901乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行冷凍消融，發(fā)現(xiàn)單純手術(shù)切除腫瘤的小鼠術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)86%，而冷凍術(shù)后小鼠腫瘤復(fù)發(fā)率僅為16%；冷凍消融導(dǎo)致血清白細(xì)胞介素12(interleukin-12， IL-12)及γ干擾素(interferon γ， IFN-γ)水平顯著升高，自然殺傷細(xì)胞活性顯著增加。臨床冷凍治療中也發(fā)現(xiàn)存在類(lèi)似抗腫瘤免疫反應(yīng)。Kato等[10]收集22例腎癌患者冷凍消融前及消融后3個(gè)月的腫瘤組織和部分患者血液樣本，發(fā)現(xiàn)冷凍消融后組織中CD8+、CD4+、顆粒酶A(GZMA)、CD11c轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高，CD8/FOXP3升高，且T細(xì)胞受體β(T cell receptor beta, TCR-β)全譜分析顯示冷凍消融引起腫瘤組織中某些T細(xì)胞擴(kuò)增，提示冷凍消融可誘導(dǎo)腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)。

1.2 冷凍消融引發(fā)免疫抑制 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷凍消融不僅引起抗腫瘤免疫反應(yīng)，還會(huì)引發(fā)免疫抑制。Wing等[11]對(duì)單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus 2， HSV-2)誘導(dǎo)的倉(cāng)鼠原發(fā)性纖維肉瘤進(jìn)行冷凍消融，發(fā)現(xiàn)冷凍消融能夠抑制具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞增殖的抑制性細(xì)胞群的產(chǎn)生，后者導(dǎo)致預(yù)后較差。Shibata等[12]認(rèn)為大鼠纖維肉瘤冷凍消融的早期階段會(huì)增加肺部轉(zhuǎn)移概率，且冷凍后不同時(shí)間段大鼠脾臟的抗腫瘤活性均低于手術(shù)切除。Blackwood等[13]對(duì)大鼠腫瘤模型進(jìn)行冷凍消融治療，發(fā)現(xiàn)若冷凍后死亡的腫瘤組織大部分留在動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，免疫反應(yīng)會(huì)被抑制；如僅留下少量冷凍組織，則繼發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)受抑制甚至消退，提示抗原刺激存在閾值，過(guò)量的抗原可能對(duì)免疫反應(yīng)不利。目前關(guān)于免疫抑制的機(jī)制尚不明確，但有研究[14]表明可能與壞死與凋亡的比例及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells， Treg)產(chǎn)生過(guò)多有關(guān)。腫瘤壞死引起細(xì)胞崩解、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致腫瘤周?chē)仔苑磻?yīng)，進(jìn)而刺激腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生；巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后，誘導(dǎo)Treg數(shù)量增加，抑制型細(xì)胞因子合成與分泌增多，刺激型細(xì)胞因子分泌減少，反之則導(dǎo)致抑制性免疫反應(yīng)[15]。

2 腫瘤免疫治療

腫瘤免疫治療的目的是利用自體免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤，可分為主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫。主動(dòng)免疫主要作用于免疫系統(tǒng)本身，包括增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的細(xì)胞因子、抗原依賴(lài)性的治療性疫苗和非抗原依賴(lài)性的用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的抑制劑；被動(dòng)免疫則作用于腫瘤本身，包括抗腫瘤單克隆抗體和過(guò)繼免疫療法(體內(nèi)激活的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)。目前臨床常見(jiàn)主要免疫治療策略包括腫瘤疫苗、過(guò)繼細(xì)胞免疫治療、溶瘤病毒、抗體或重組蛋白等。腫瘤疫苗可通過(guò)特異性激活宿主T細(xì)胞以對(duì)抗腫瘤抗原，但由于抗原選擇困難和對(duì)腫瘤免疫機(jī)制理解欠缺導(dǎo)致其療效并不理想。溶瘤病毒免疫療法是利用自然或合成的病毒選擇性復(fù)制和殺死癌細(xì)胞，其作用機(jī)制包括腫瘤感染引起的急性腫瘤減瘤、腫瘤細(xì)胞裂解及全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和啟動(dòng)。溶瘤病毒T-VEC是目前臨床應(yīng)用于晚期黑色素瘤的免疫藥物，它是一種經(jīng)改良的Ⅰ型單純皰疹病毒，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不會(huì)損傷神經(jīng)元[16]。過(guò)繼細(xì)胞療法首先從患者的腫瘤組織、引流淋巴結(jié)或外周血中分離出淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后的淋巴細(xì)胞被重新注入患者體內(nèi)，利用其抗腫瘤特性來(lái)消滅全身的腫瘤細(xì)胞[17]。

免疫檢查點(diǎn)阻斷治療目前被認(rèn)為是最有希望和潛力的免疫治療方法。免疫檢查點(diǎn)指免疫細(xì)胞膜表面上傳導(dǎo)抑制表達(dá)信號(hào)的分子，正常情況下能保護(hù)身體免受劇烈的自身免疫反應(yīng)，但在腫瘤微環(huán)境中可使腫瘤細(xì)胞成功逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。目前研究最多的免疫檢查點(diǎn)分子主要為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4， CTLA-4)和程序性死亡受體-1(programmed death-1， PD-1)，通過(guò)阻斷相應(yīng)的免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路，可恢復(fù)T細(xì)胞的活化和增殖能力、增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[3]。一項(xiàng)納入4項(xiàng)臨床試驗(yàn)、2 174例腫瘤患者的Meta分析[18]指出，當(dāng)腫瘤細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)陽(yáng)性表達(dá)率>1%時(shí)，經(jīng)抗PD-1/PD-L1抗體治療的進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival， PFS)和總生存期(overall survival， OS)均明顯高于接受化療者，且安全性更好。Teng等[19]根據(jù)腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達(dá)水平和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrates lymphocytes， TIL)的存在與否將腫瘤分為4種不同類(lèi)型：Ⅰ型，PD-L1(+)、TIL(+)，即適應(yīng)性免疫抵抗型；Ⅱ型，PD-L1(-)、TIL(-)，即免疫忽視型；Ⅲ型，PD-L1(+)、TIL(-)，即內(nèi)在誘導(dǎo)型；Ⅳ型，PD-L1(-)、TIL(+)，即免疫耐受型。不同類(lèi)型腫瘤對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑的應(yīng)答程度不盡相同，其中Ⅰ型的應(yīng)答率及效果最佳。聯(lián)合使用PD-1和CTLA-4抑制劑可明顯提高免疫治療效果。Wang等[20]報(bào)道，聯(lián)合抗CTLA-4和抗PD-1抗體可明顯抑制胃癌MKN-45和MGC-803細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，體現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。

3 免疫治療與冷凍消融的協(xié)同抗腫瘤作用

冷凍消融刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，結(jié)合特異性免疫治療可促進(jìn)和增強(qiáng)這種免疫效應(yīng)。Zhu等[8]采用PD-1抑制劑聯(lián)合冷凍消融治療小鼠腎細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)給藥或單純冷凍，且PD-1抑制劑對(duì)冷凍引起的免疫反應(yīng)具有明顯增強(qiáng)作用(包括CD8+TIL數(shù)目增加、INF-γ和GZMB mRNA表達(dá)水平增加)。Li等[21]觀察冷凍消融聯(lián)合IL-12治療大鼠異種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)抗腫瘤免疫的影響，發(fā)現(xiàn)冷凍聯(lián)合IL-12治療的細(xì)胞免疫功能顯著增強(qiáng)，腫瘤消退，且后續(xù)超免疫活性明顯增強(qiáng)，其中CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞和CD86+淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，IFN-γ表達(dá)也明顯增加。此外，Benzon等[22]探討腫瘤冷凍消融和免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體之間的潛在協(xié)同抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體治療使前列腺癌移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)延遲了14.8天，且死亡率較單純冷凍消融降低4倍，提示抗CTLA-4抗體可顯著增強(qiáng)冷凍消融介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Waitz等[23]針對(duì)小鼠前列腺癌模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用CTLA-4抗體與冷凍消融可有效抑制或減緩繼發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或引發(fā)腫瘤排斥反應(yīng)。但是，冷凍消融聯(lián)合免疫治療的效果及安全性的臨床證據(jù)還不充分，目前僅有少數(shù)研究得到與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，如Niu等[24]回顧性評(píng)估冷凍消融聯(lián)合免疫治療對(duì)轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的療效，經(jīng)過(guò)4年隨訪發(fā)現(xiàn)患者中位生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于接受單純冷凍治療或化學(xué)治療者；Liu等[25]觀察冷凍消融聯(lián)合索拉非尼治療晚期腎細(xì)胞癌的療效和安全性，發(fā)現(xiàn)接受聯(lián)合治療的患者對(duì)藥物的反應(yīng)率、疾病控制率均明顯高于接受索拉非尼單藥治療者，PFS及OS均明顯長(zhǎng)于索拉非尼單藥治療，且聯(lián)合治療者免疫相關(guān)指標(biāo)均明顯改善，而未增加不良反應(yīng)。目前PD-1/PD-L1抑制劑是治療腫瘤組織PD-L1表達(dá)>50%、且未發(fā)現(xiàn)分子致癌靶點(diǎn)的非小細(xì)胞肺癌的一線方法，但在大多數(shù)臨床試驗(yàn)[26]中應(yīng)答率僅約20%，原因可能與腫瘤微環(huán)境中較少TIL浸潤(rùn)有關(guān)[27]。

冷凍消融與免疫治療協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制目前尚不明確。冷凍消融導(dǎo)致腫瘤抗原大量釋放至宿主免疫系統(tǒng)，CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞和CD86+淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，IFN-γ水平增高標(biāo)志著TH1型免疫反應(yīng)增強(qiáng)[28]。冷凍消融可能產(chǎn)生大量自體抗原，于消融術(shù)后數(shù)日甚至數(shù)周內(nèi)被釋放到血液循環(huán)中。從腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性群體中提取的多種腫瘤特異性抗原的原位多價(jià)自接種疫苗將提供給宿主已啟動(dòng)的免疫系統(tǒng)，有利于全身定位、識(shí)別、靶向和破壞腫瘤細(xì)胞。當(dāng)宿主的免疫系統(tǒng)被PD-L1或CTLA-4抑制劑“啟動(dòng)”時(shí)，促發(fā)Treg細(xì)胞、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)宿主對(duì)腫瘤的免疫力，不僅使原發(fā)腫瘤消退，還可引起轉(zhuǎn)移性癌灶消退。如通過(guò)給予PD-1和/或CTLA-4抗體或抑制劑阻斷腫瘤免疫逃逸機(jī)制，體內(nèi)自體抗原被免疫系統(tǒng)處理，在冷凍消融產(chǎn)生自體抗原之前啟動(dòng)自身免疫系統(tǒng)，使腫瘤抗原和宿主的免疫系統(tǒng)繞過(guò)癌細(xì)胞的防御機(jī)制，達(dá)到成功治療腫瘤的目的[29]。

總之，冷凍消融聯(lián)合全身免疫治療可提高局部實(shí)體腫瘤治療效果。冷凍速率、血液抗原監(jiān)測(cè)客觀量化指標(biāo)以及聯(lián)合全身免疫治療的相關(guān)模式、給藥時(shí)機(jī)和治療監(jiān)控等未來(lái)將會(huì)進(jìn)一步完善。