蛇床子素體外對(duì)酵母相馬爾尼菲籃狀菌的抗菌活性檢測(cè)

羅秋紅 潘開(kāi)素 羅宏 曹存巍

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，南寧 530023；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，南寧 530021

馬爾尼菲籃狀菌（Talaromyces marneffei，TM）為雙相真菌，在25℃呈菌絲相，37℃致病狀態(tài)時(shí)為酵母相。TM感染引起的馬爾尼菲籃狀菌病是一種兇險(xiǎn)的極易死亡的系統(tǒng)性真菌病，在廣西有區(qū)域性流行［1］。馬爾尼菲籃狀菌病進(jìn)展快，若不及時(shí)治療，病死率可高達(dá)91.3%［2］。由于兩性霉素B等常用抗真菌藥治療馬爾尼菲籃狀菌病不良反應(yīng)多，患者不耐受且易復(fù)發(fā)［3］，尋找有效低毒的抗真菌藥是控制病情的關(guān)鍵。研究顯示，蛇床子對(duì)新型隱球菌、鐮刀菌、白念珠菌、曲霉等臨床分離的9種病原真菌有抑制作用［4］。然而，迄今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)蛇床子對(duì)TM抗菌活性的研究報(bào)道。蛇床子素是蛇床子的主要成分［5］，我們以蛇床子素對(duì)TM進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，為蛇床子治療馬爾尼菲籃狀菌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）菌株來(lái)源：馬爾尼菲籃狀菌20株，其中1株為標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161，由澳大利亞墨爾本大學(xué)Alex Andronopolous教授惠贈(zèng)；11株為臨床患者分離株（2015—2017年于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離），編號(hào)為1～11；6株為野生竹鼠分離株，編號(hào)為12～17，臨床分離株及野生株均系北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保存菌株。2株氟康唑天然耐藥株A1、A3，為廣西醫(yī)科大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室保存菌株［6］。所有菌株均經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。近平滑念珠菌ATCC22019為質(zhì)控株。

（二）藥物來(lái)源：蛇床子素（人工合成）、氟康唑、兩性霉素B（AmB）、伊曲康唑、伏立康唑原粉均來(lái)自美國(guó)Sigma公司，純度均為98%，等級(jí)為二級(jí)。其中氟康唑溶解于高壓滅菌水中，配成1 280 mg/L儲(chǔ)存液；AmB、伊曲康唑、伏立康唑溶解在100%二甲基亞砜中，獲得的儲(chǔ)存液濃度均為1 600 mg/L；蛇床子素溶解于二甲基亞砜，配成12 800 mg/L儲(chǔ)存液。所有藥物儲(chǔ)存液-20℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將藥物稀釋至2倍終濃度工作液。

（三）方法：

1.菌懸液制備：實(shí)驗(yàn)前將TM受試菌接種在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，每7天傳代1次，傳3代。取1 ml滅菌水加入試管內(nèi)，輕抽吸后，將菌懸液吸至無(wú)菌試管中靜置10～15 min，取上清液振蕩15 s，用比濁儀（法國(guó)生物梅里埃公司）調(diào)整菌懸液濃度至（1～5）×106菌落形成單位（CFU）/ml，再用RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋至（1～5）×103CFU/ml。

2.藥敏板制備：向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔加入2倍終濃度藥液100 μl。第1～10列各孔藥物濃度范圍：氟康唑0.125～64 mg/L（A1、A3為氟康唑天然耐藥株，藥物濃度范圍1～512 mg/L），AmB 0.125～64 mg/L。伊曲康唑、伏立康唑濃度范圍參考文獻(xiàn)［7］定為0.002～1.024 mg/L。蛇床子素為2～1 024 mg/L。取100 μl（不含藥液）RPMI 1640液體培養(yǎng)基加入第11列各孔中作為TM生長(zhǎng)對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照）；取200 μl RPMI 1640液體培養(yǎng)基加入第12列各孔中，不接種TM，作為陰性對(duì)照。配制好的藥敏板存放在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.液體培養(yǎng)基的接種：在96孔培養(yǎng)板上除第12列陰性對(duì)照孔外，其余各孔均加入（1～5）×103CFU/ml菌液100 μl，37℃下培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，每株實(shí)驗(yàn)菌株均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取中位值。每次實(shí)驗(yàn)均使用ATCC22019近平滑念珠菌進(jìn)行質(zhì)控。

4.最低抑菌濃度（MIC）結(jié)果判定：用視覺(jué)法判定終點(diǎn)，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所頒布的酵母菌抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方案M27-A2進(jìn)行判定［8］。與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比，≥80%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為氟康唑的MIC；兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、蛇床子素MIC定義為100%生長(zhǎng)抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度。MIC50及MIC90分別為能抑制50%或90%受試菌所需的最低藥物濃度。

二、結(jié)果

質(zhì)控株MIC值均在參考范圍內(nèi)，生長(zhǎng)對(duì)照孔中真菌生長(zhǎng)良好。各藥物的MIC值范圍：氟康唑2.0～8.0 mg/L（氟康唑天然耐藥株為128 mg/L），AmB 1.0～4.0 mg/L，伊曲康唑0.03～0.25 mg/L，伏立康唑0.06～0.25 mg/L。11號(hào)臨床株對(duì)AmB耐藥（MIC值為4.0 mg/L），其余菌株均對(duì)AmB敏感。所有菌株對(duì)伊曲康唑及伏立康唑均敏感。蛇床子素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161的MIC為16 mg/L，對(duì)氟康唑天然耐藥株的MIC均為32 mg/L，對(duì)11號(hào)菌株MIC為32 mg/L，對(duì)第16號(hào)菌株MIC為128 mg/L，對(duì)其余16株TM的MIC值范圍為16～64 mg/L，MIC90以及MIC50分別為64和32 mg/L。

三、討論

蛇床子為傘形科一年生草本植物蛇床的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)燥濕、止癢的功效。蛇床子的有效成分主要集中在香豆素，而蛇床子素約占總香豆素的60%，含量最高［5］。蛇床子素對(duì)真菌有殺滅和抑制作用［9-10］。李晶紅等［11］發(fā)現(xiàn)，蛇床子乙醇提取物對(duì)白念珠菌的MIC為0.312 5～2.5 g/L，蛇床子提取物對(duì)受試菌種（包括白念珠菌、乳桿菌等）的平均MIC值為2.5 g/L。于軍等［4］應(yīng)用粉碎機(jī)對(duì)中藥蛇床子進(jìn)行粉碎，超聲波提取，循環(huán)水式過(guò)濾，回流濃縮，應(yīng)用試管法檢測(cè)蛇床子對(duì)新型隱球菌、鐮刀菌、白念珠菌、曲霉等臨床分離的9種致病真菌的作用，發(fā)現(xiàn)蛇床子的MIC均為25 g/L。王麗納等［12］研究認(rèn)為，蛇床子乙醇提取液可以通過(guò)抑制Hsp60和Hsp90的表達(dá)抑制紅色毛癬菌增殖，且這種抑制呈濃度依賴性，其對(duì)紅色毛癬菌的MIC值為6.64 g/L。以上研究多采用蛇床子乙醇提取液或者水提液，測(cè)得MIC數(shù)值較高。聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)研究顯示，氟康唑與蛇床子素聯(lián)合體外對(duì)耐氟康唑的白念珠菌具有協(xié)同抗菌作用［13］。本研究中幾種常用抗真菌藥物氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑?qū)M的MIC與既往文獻(xiàn)報(bào)道相似［14-16］。本研究中大部分菌株對(duì)AmB敏感（MIC值范圍1.0～2.0 mg/L），僅有11號(hào)菌株對(duì)AmB耐藥（MIC值為4 mg/L，MIC值＞2.0 mg/L被認(rèn)為耐藥［15］），而蛇床子素對(duì)11號(hào)菌株MIC為32 mg/L，提示對(duì)AmB耐藥的馬爾尼菲籃狀菌病可以嘗試用蛇床子素治療。本研究中蛇床子素對(duì)第16號(hào)菌株MIC值為128 mg/L，數(shù)值相對(duì)增高，其原因仍有待進(jìn)一步研究。蛇床子素對(duì)氟康唑天然耐藥株（A1、A3）的MIC均為32 mg/L，與蛇床子素的MIC50一致，其結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于氟康唑?qū)1、A3的MIC 128 mg/L，提示蛇床子素對(duì)氟康唑天然耐藥株依然有抑制作用。蛇床子素對(duì)其他TM菌株以及FRR2161的MIC值范圍為16～64 mg/L，MIC90以及MIC50分別為64和32 mg/L，與既往蛇床子對(duì)真菌的活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果［4，10-12］比較，蛇床子素的MIC數(shù)值較小，抗TM敏感性高，提示蛇床子抗TM活性主要集中在單體蛇床子素。

總之，本實(shí)驗(yàn)以蛇床子素對(duì)酵母相TM進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)酵母相馬爾尼菲籃狀菌有較強(qiáng)的抑制活性，氟康唑天然耐藥株以及兩性霉素B耐藥株也對(duì)蛇床子素敏感，該結(jié)果將為今后從中醫(yī)藥方面治療馬爾尼菲籃狀菌病提供理論依據(jù)。蛇床子中除蛇床子素之外的其他單體如佛手柑內(nèi)酯、異虎耳草素等［5］是否對(duì)TM也有抑制作用，尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突