自然老化對女性皮膚微生物組多樣性的影響

人體最大的器官—皮膚，被各種微生物（包括真菌、細菌、古細菌和病毒）覆蓋著，其中細菌占比最多。一些研究表明，皮膚微生物組的組成是由包括皮脂分泌和環(huán)境干濕情況在內(nèi)的皮膚微生物群落生境來決定的。另外，年齡和性別等多種宿主因素也會影響健康個體的皮膚微生物組。皮膚微生物組是一個動態(tài)可變且復雜的生態(tài)系統(tǒng)，因此也被稱為皮膚微生態(tài)。皮膚微生態(tài)平衡的維持對皮膚健康十分重要。

隨年齡增長，受內(nèi)源性（如細胞代謝、免疫活性、激素狀態(tài)）和外源性（如紫外線、污染物、其他毒素）因素的共同作用，皮膚會發(fā)生老化，其結(jié)構(gòu)和功能都會出現(xiàn)漸進性改變。例如，隨年齡增長，汗液和皮脂的分泌會減少，免疫功能會降低，這些變化會導致皮膚表面生理指標出現(xiàn)顯著變化，pH值、脂質(zhì)組成和皮脂分泌都會受到影響。而上述這些生理變化可引起皮膚微生態(tài)的潛在改變，從而影響皮膚表面微生物組的信息。有研究者通過分析不同年齡段人群皮膚微生物組，展示了人類從嬰兒期至青春期再到成人期皮膚微生物組的轉(zhuǎn)變和過渡，以及人口起源和居住環(huán)境對成人皮膚微生物組的影響。但是，關(guān)于年齡（自然老化）對不同皮膚部位微生物組的影響研究還很少。

為排除性別影響，該研究僅針對女性志愿者展開。對年輕組和年長組日本女性的皮膚表面細菌多樣性和組成特征進行了對比研究，樣本采集于4處不同的皮膚部位，分別代表干燥（前臂屈側(cè)）和油性（頭皮、前額、面頰）皮膚區(qū)域，并利用高通量焦磷酸測序獲得的16S rRNA 基因序列數(shù)據(jù)對細菌群落進行分析評估。

一、材料和方法

1.志愿者和樣本收集：招募生活在日本東京郊區(qū)的37名健康女性志愿者，無吸煙史且無痤瘡或特應性皮炎等皮膚疾病，年輕組18名（21 ～37歲，平均年齡27.3歲），年長組19名（60 ～76歲，平均年齡67.4歲）。要求志愿者在采樣前2 d 使用專門提供的不含抗菌物的洗發(fā)水清潔頭皮和頭發(fā)，采樣時不可使用任何洗發(fā)、護發(fā)或造型產(chǎn)品。采樣前還要求使用指定產(chǎn)品卸妝1次和潔面2次。最后1次潔面后，志愿者保持沉默（避免飛沫影響面部菌群）并休息2 h。隨后在22 ℃、60%濕度的室內(nèi)，用無菌棉簽分別對每個志愿者頭皮、前額、面頰和前臂屈側(cè)皮膚進行采樣。

2.DNA 提取、PCR 擴增測序以及統(tǒng)計學分析具體內(nèi)容請參考原文。

二、結(jié)果

1.樣品采集和16S rRNA基因V1-V2區(qū)測序：分析所有志愿者4 個部位皮膚的148 份樣本的菌群信息。使用454 GS FLX Titanium 平臺對細菌的 16S rRNA 基因 V1-V2 區(qū)（16S）測序，經(jīng)質(zhì)量和大小篩選之后，共獲得1 019 132個讀數(shù)。148 份樣本中，每個皮膚部位的總讀數(shù)范圍為2 601 ～25 904個，每個樣本的平均讀數(shù)為6 886個。

按照標識閾值≥96%對高質(zhì)量的16S 讀數(shù)進行聚類，所有樣本共生成4 156個運算的分類單位（OTUs）。分析數(shù)據(jù)表明，這4 個部位皮膚的樣本量足以計算和覆蓋37 名志愿者中至少兩人共有的OTUs。

2.年輕組與年長組皮膚微生物組α 多樣性（同一樣本中物種豐富度）的差異：首先，根據(jù)觀察到的和Chao1 估算的OTUs 數(shù)量以及Shannon 指數(shù)，對4 個部位皮膚微生物組的α多樣性進行分析。稀疏曲線示前臂屈側(cè)皮膚微生物組α多樣性最高，另外3處結(jié)果相似；其次是面頰和前額（兩者α 多樣性相近），頭皮微生物組α多樣性最低。為了進一步闡明每處皮膚微生物組的年齡特異性特征，還比較了年輕與年長組的α多樣性?；谟^察到的OTUs 值，年長組4個部位皮膚菌種的豐富度均明顯高于年輕組，且年長組Chao1估算的OTUs和Shannon指數(shù)均高于年輕組。表明年長組4處微生物組α 多樣性均高于同部位的年輕組。從3個指標來看，面頰和前額微生物組的α 多樣性在兩個年齡組間均出現(xiàn)了顯著的統(tǒng)計學差異。

3.年輕組與年長組皮膚微生物組β 多樣性（不同樣本間物種多樣性）的差異：使用UniFrac-主坐標分析和UniFrac距離分析對4個部位皮膚的微生物組整體結(jié)構(gòu)的相似性和變異性進行比較。加權(quán)和未加權(quán)的UniFrac-PCoA均顯示，結(jié)果根據(jù)皮膚部位而呈聚集傾向。通過置換多變量方差分析（PERMANOVA）對這些差異進行評估，結(jié)果顯示差異顯著。

UniFrac 分析發(fā)現(xiàn)，兩組間4 個部位皮膚微生物組β 多樣性差異顯著。年輕組與年長組最高分離曲線出現(xiàn)在加權(quán)UniFrac 分析的前臂微生物組中，以及未加權(quán)UniFrac 分析的頭皮微生物組中。表明前臂屈側(cè)和頭皮微生物組β多樣性的改變與年齡有關(guān)，且菌種的豐度和組成變化分別有助于前臂和頭皮微生物組與年齡相關(guān)的多樣化。相較其他3個部位皮膚微生物組（0.9 ～1.6倍），菌種組成對頭皮微生物組β多樣性差異的貢獻主要是由于在年長組中觀察到的OTUs數(shù)量顯著增加（約為年輕組的3.8 倍）。還發(fā)現(xiàn)由少量16S讀數(shù)組成的次要菌種/OTUs 的數(shù)量在年長組的頭皮微生物組呈特征性增加，而同組其他3 個部位皮膚微生物組未觀察到顯著增加。

4.不同年齡組皮膚微生物組的分類學差異：根據(jù)微生物16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫中的種系型對OTUs進行分類。門級分類顯示，4個主要門類（厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門）在4 個部位皮膚微生物群落中占據(jù)主導地位。其中，放線菌門占比最多，其平均豐度在面頰、前臂、前額和頭皮部位分別為61.8%、40.3%、67.6%和83.3%。而且，年長組面頰、前臂和前額微生物組中放線菌門的豐度明顯低于年輕組，其他3 個門類的豐度則呈現(xiàn)為增加。年長組前臂放線菌門相對豐度的減少（約為0.6倍）最為顯著，前臂和頭皮變形菌門的豐度明顯高于年輕組，前額厚壁菌門和擬桿菌門的豐度明顯高于年輕組，面頰擬桿菌門的豐度明顯高于年輕組。上述數(shù)據(jù)揭示了兩個年齡組間4個部位皮膚微生物組整體分類學的差異。

屬級分類顯示6 個屬（丙酸桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、鏈球菌屬、不動桿菌屬和普氏菌屬）占比較大，平均豐度均≥1%。其中，丙酸桿菌屬占絕大多數(shù)，在頭皮、前額、面頰和前臂樣本中總檢出量分別約為78%、57%、52%和19%。兩個年齡組6 個主要屬的豐度對比顯示，年長組面頰、前臂和前額微生物組中丙酸桿菌屬的豐度明顯低于年輕組。這與年長組這3種微生物菌群中放線菌門明顯減少的結(jié)果是一致的（丙酸桿菌歸屬于放線菌門）。此外，年長組前臂微生物組中葡萄球菌屬的豐度明顯低于年輕組，面頰和前額棒狀桿菌屬則顯著增加。不動桿菌屬僅在前臂占優(yōu)勢，與年輕組相比，在年長組前臂和頭皮微生物群中明顯增加。年長組鏈球菌屬和普氏菌屬也較年輕組顯示出較高的豐度，但結(jié)果不顯著。

為了進一步確定兩組間與年齡相關(guān)的皮膚微生物菌種信息，使用線性判別分析（LDA）效應值（LEfSe）方法，鑒定出38個菌種/OTUs LDA評分有顯著性改變，其中31個菌種在年長組皮膚中過度表達，另外7 個（其中5 個為丙酸桿菌屬）在年輕組皮膚中富集。至于皮膚部位，在面頰、前臂、前額和頭皮中出現(xiàn)顯著性改變的菌種分別為19 個、18 個、22個和13個。其中，15個菌種表現(xiàn)出皮膚部位特異性改變，在面頰、前臂、前額和頭皮中分別為3個、5個、4個和3個。其他23個菌種在兩個以上的不同部位皮膚發(fā)生改變，只有克雷伯菌和普氏菌在年長組的所有皮膚部位都發(fā)生了富集。為了確定這38個菌種的皮膚部位特異性，該研究還對口腔中檢測到菌種的CORE數(shù)據(jù)庫進行了相似性搜索。結(jié)果顯示，30 個菌種的16S 序列與CORE 數(shù)據(jù)庫中物種的相似性≥97%，其中16 個被認為是正常的口腔細菌，它們的不同CORE IDs序列≥3。這16個菌種歸屬于鏈球菌屬、羅氏菌屬、韋榮球菌屬、普氏菌屬、梭菌屬和嗜血桿菌屬，所有這些都是口腔細菌群落的核心成員，在年長組的4 個皮膚部位均有明顯富集。

5.細菌多樣性與臨床皮膚參數(shù)的關(guān)系：為了解哪些皮膚問題與老化相關(guān)的皮膚微生態(tài)多樣性有關(guān)，該研究還對一些細菌數(shù)據(jù)與志愿者實際年齡和皮膚臨床參數(shù)（包括皮膚回聲、厚度、毛孔面積、面頰色斑大小以及前額皮脂分泌水平和pH值等皮膚生理參數(shù)）進行相關(guān)性分析。在面頰部參數(shù)中，毛孔密度和皮膚彈性與志愿者年齡呈負相關(guān)，而色斑密度和真皮深層回聲與志愿者年齡呈正相關(guān)且有統(tǒng)計學意義。前額皮脂分泌水平也與志愿者年齡呈負相關(guān)。另一方面，與年齡無顯著相關(guān)性的色斑面積與Shannon指數(shù)呈正相關(guān)，與面頰丙酸桿菌屬的豐度呈負相關(guān)，且具有統(tǒng)計學意義。

三、討論

該研究顯示，成年女性皮膚部位對皮膚微生物組的構(gòu)成有重要影響。面頰與前額微生物組中菌種豐度和組成都有很高的相似性。前臂微生物組α多樣性最高，頭皮最低，與之前報道的干燥區(qū)域（如前臂）的細菌多樣性高于皮脂分泌區(qū)域（如頭皮、前額、面頰）的結(jié)果相似。

數(shù)據(jù)顯示，年長組皮膚微生物組α 多樣性/菌種豐度高于年輕組。該結(jié)論與一項中國研究相似，但有別于另一項研究，提示皮膚微生物組與年齡的相關(guān)性雖然取決于皮膚的部位，但生活方式、居住環(huán)境和性別差異也需要考慮。

在4 個皮膚部位微生物組β 多樣性的年齡相關(guān)性差異中，前臂、頭皮的差異比面頰、前額更為顯著。兩組間頭皮微生物組的差異很大程度上源于菌種組成，表現(xiàn)為年長組頭皮上次要菌種數(shù)量顯著增加。另一方面，兩組間前臂的差異很大程度上應歸因于菌種的豐度，這可以通過年長組前臂微生物組中最主要種屬丙酸桿菌屬數(shù)量的明顯減少來解釋。因此證實，皮膚微生物組的年齡相關(guān)性變化與皮膚具體部位有關(guān)。

在4個部位皮膚中，年輕組與年長組OTUs/菌種數(shù)量差異最大的是頭皮，但Shannon 指數(shù)的差異沒有統(tǒng)計學意義。這可能是因為頭皮微生物組中丙酸桿菌屬的豐度極高（約80%）導致菌種的均勻度變化較小。

在前額、面頰和前臂，年長組皮膚微生物組多樣性的增加與丙酸桿菌屬相對豐度顯著降低同時發(fā)生，這可能與老年人皮脂分泌減少有關(guān)。年長組前額平均皮脂分泌水平約為年輕組的一半，前額皮脂分泌水平與丙酸桿菌屬的豐度呈正相關(guān)。與該結(jié)果一致，有研究報道，丙酸桿菌屬會優(yōu)先定植于富含皮脂衍生脂類的部位，且痤瘡丙酸桿菌的密度與皮膚上的脂質(zhì)總量呈正相關(guān)。因為該菌是重要的皮膚共生微生物之一，能夠分泌抗菌物質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)和短鏈脂肪酸而使宿主受益，丙酸桿菌屬的耗盡會削弱這些益處，從而促進臨床/生理性皮膚老化的跡象。

LefSE 分析確定了38 個菌種，很大程度上幫助區(qū)分了兩個年齡段皮膚微生物組，其中大部分在年長組樣本中有明顯的過度表達，包括在口腔中檢測到的許多正常細菌。此結(jié)果表明，口腔細菌在很大程度上促進了年長組皮膚細菌的改變及多樣性。因為在年長組皮膚檢測到的口腔菌種相對豐度足夠高，且有較高的部位特異性，因此可以排除口腔菌種短暫定植的可能性。盡管數(shù)據(jù)支持皮膚與口腔細菌間存在年齡依賴性的相互聯(lián)系，但目前這些定植在皮膚上的口腔細菌的生物學作用基本上是未知的。另一方面，口腔細菌豐度高被認為是該研究中老化皮膚微生物組的一個特征。

總之，結(jié)果表明，年輕人皮膚的微群落生境對皮膚菌群定植的選擇壓力大于年長者皮膚，導致年輕人皮膚微生物組中個體變異性和菌種豐度都低于年長者皮膚。上述變化是由于年長者皮膚細胞更新減慢、汗液和皮脂腺功能下降，以及免疫系統(tǒng)功能減弱等。

皮膚參數(shù)與微生物組相關(guān)性分析顯示，存在兩種不同的相關(guān)性模式，即年齡相關(guān)模式和非年齡相關(guān)模式。通過幾種皮膚參數(shù)如皮脂分泌水平、毛孔密度和與皮膚彈性隨年齡的增長而降低，以及色斑密度和真皮深層回聲隨年齡的增長而增加這一現(xiàn)象，可以觀察到與年齡和一些微生物組數(shù)據(jù)均有相關(guān)性。這些與年齡有關(guān)的相關(guān)性可以通過不同的年齡相關(guān)現(xiàn)象來說明一種間接的關(guān)聯(lián)。相反，色斑面積代表了非年齡相關(guān)性參數(shù)，該參數(shù)與年齡無關(guān)，但與Shannon指數(shù)呈正相關(guān)，與丙酸桿菌屬和普氏菌屬的豐度呈負相關(guān)。眾所周知，色斑面積會隨著日照增加而增大，這表明其與皮膚的光老化有關(guān)，而不是與自然老化有關(guān)。因為光老化是由環(huán)境中的日光照射所導致，所以日照和非日照皮膚微生物組的進一步對比研究可以闡明環(huán)境和宿主對皮膚微生物組影響的差異。

綜上所述，老化對日本女性皮膚微生物組多樣化和多樣性的變化具有重要影響。也可以認為，隨年齡變化的皮膚微生物組多樣化與皮膚生理變化有關(guān)。因此，皮膚微生物組可以作為一種新的指標來量化皮膚的年齡，無論其實際年齡如何。據(jù)報道菌群分類與功能多樣性之間存在顯著相關(guān)性，因此通過宏基因組學和代謝組學來闡明老年人皮膚特有的功能特征，對深入了解老化的皮膚和探討預防皮膚問題（特別是老年人皮膚問題）的新方法可提供依據(jù)。