柴油機(jī)尾氣顆粒提取物對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白組學(xué)的影響及抗氧化劑在皮膚健康中的作用

眾所周知，空氣污染威脅著人類的健康，而工業(yè)和車輛排放的廢氣是戶外空氣污染最主要的來源。柴油機(jī)排放物主要包括大小不同的碳質(zhì)顆粒、脂肪烴、多環(huán)芳烴（PAH）及其衍生物、一氧化碳、硫和一氧化氮等氣體。柴油機(jī)尾氣顆粒物對(duì)人體造成有害影響的主要機(jī)制是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致皮膚外源性老化的一個(gè)重要因素。

除顆粒物外，柴油機(jī)尾氣還含有醛類、苯、1,3-丁二烯、PAH和硝基PAH等，也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生刺激的揮發(fā)性混合物。顆粒物表面會(huì)吸附40多種已知和300多種未知的PAH，占柴油機(jī)尾氣中揮發(fā)性成分的絕大多數(shù)。許多體內(nèi)和體外研究已將PAH和活性氧（ROS）產(chǎn)物的細(xì)胞代謝與細(xì)胞毒性聯(lián)系了起來。有研究表明，柴油機(jī)尾氣和香煙煙霧中的PAH可以引發(fā)呼吸道炎癥反應(yīng)。最近有研究還顯示PAH與UVA1協(xié)同作用來破壞皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。盡管許多研究分析了柴油機(jī)尾氣中氣相組分的影響，但關(guān)注重點(diǎn)是PAH，缺乏對(duì)總氣相的無偏性研究。目前還沒有皮膚長(zhǎng)期暴露于柴油機(jī)尾氣顆粒提取物（DPE）及其蒸氣下的高通量研究。

本研究旨在闡明長(zhǎng)期暴露于柴油機(jī)尾氣對(duì)皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞（NHEK-Ad）的影響。采用定量蛋白組學(xué)的方法觀察角質(zhì)形成細(xì)胞暴露于DPE或其蒸氣（DPE-V）時(shí)分子水平的改變，并進(jìn)行基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)分析，定量4 490個(gè)蛋白質(zhì)。其中，在暴露于DPE和DPE-V相的角質(zhì)形成細(xì)胞中分別發(fā)現(xiàn)有201個(gè)和374個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化均大于1.5倍（P≤0.05）。該研究表明，DPE及其蒸氣可顯著改變幾種蛋白的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，這些蛋白參與維持皮膚上皮完整性，調(diào)節(jié)皮膚水合作用和氧化應(yīng)激，同時(shí)維生素E處理能夠減輕DPE或其蒸氣對(duì)皮膚的不良影響。

一、材料和方法（詳見原文）

二、結(jié)果和討論

建立新細(xì)胞模型來研究長(zhǎng)期暴露于DPE及DPE-V對(duì)人皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，作用后的細(xì)胞組分別為NHEK-Ad-DPE和NHEK-Ad-DPE-V。已知柴油機(jī)尾氣及其中的PAH和衍生物會(huì)增加ROS水平來影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化還原平衡。有研究證實(shí)，柴油機(jī)尾氣顆粒物可以產(chǎn)生ROS，引起氧化損傷并增加ROS的產(chǎn)生或蓄積，導(dǎo)致組織損傷。此外，ROS增加還會(huì)涉及包括老化和皮膚損傷在內(nèi)的多種細(xì)胞過程。

1.長(zhǎng)期暴露于DPE及DPE-V可誘導(dǎo)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（NRF2）表達(dá)：為中和ROS的毒性作用，一些抗氧化蛋白和某些解毒酶，如NADPH醌氧化還原酶、γ谷氨酰胺半胱氨酸合成酶和血紅素氧合酶1，會(huì)通過抗氧化反應(yīng)元件被轉(zhuǎn)錄因子激活。NRF2是負(fù)責(zé)抗氧化反應(yīng)元件調(diào)控基因構(gòu)成性和誘導(dǎo)性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。蛋白印跡結(jié)果顯示，NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中NRF2的表達(dá)相對(duì)于NHEK-Ad細(xì)胞有所增加。

2.DPE及其蒸氣暴露會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中普遍的蛋白組學(xué)改變：采用基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）的定量蛋白組學(xué)方法研究長(zhǎng)期暴露于DPE或DPE-V中的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的變化。共有4 490個(gè)蛋白質(zhì)被定量和反復(fù)驗(yàn)證，分別在NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中發(fā)現(xiàn)374個(gè)和201個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)變化程度≥1.5倍（P≤0.05）。

兩組細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)變化的蛋白包括角蛋白A、Suprabsin亞型1和抗白細(xì)胞蛋白酶。角蛋白A屬于SPRR蛋白家族，是一種參與角化過程的結(jié)構(gòu)蛋白?？拱准?xì)胞蛋白酶或分泌性白細(xì)胞肽酶抑制劑是一種分泌抑制劑，可保護(hù)上皮組織免受絲氨酸蛋白酶的影響。

該研究還用DPE及DPE-V處理體外重建表皮模型EpiSkin（RHETM EpiSkinTM），數(shù)據(jù)重現(xiàn)了前面細(xì)胞體外培養(yǎng)所觀察到的蛋白組學(xué)結(jié)果。

正常角質(zhì)形成細(xì)胞可以在支持增殖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。然而，暴露于DPE和DPE-V可導(dǎo)致一些參與細(xì)胞分化過程的蛋白表達(dá)變化。該研究采用生物信息學(xué)分析來闡明由于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞慢性暴露于DPE或DPE-V中可能受到影響的生物過程。

3.暴露于DPE或DPE-V會(huì)影響與皮膚屏障功能及皮膚完整性相關(guān)的蛋白質(zhì)：在兩組細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，多種具有皮膚生物學(xué)作用的蛋白均出現(xiàn)表達(dá)變化。兩組中均觀察到斑蛋白家族成員下調(diào)，包括周斑蛋白、包斑蛋白、外皮蛋白和epiplakin。斑蛋白家族是角質(zhì)形成細(xì)胞中完成角質(zhì)化上皮形成和維持上皮屏障完整性所必需的。兩組暴露條件的細(xì)胞內(nèi)，維持上皮屏障完整性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑A、半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、sciellin、角蛋白A、角蛋白B和富含脯氨酸的小蛋白2D等蛋白均顯著下調(diào)。此外，在皮膚水合過程中起重要作用的絲聚蛋白也出現(xiàn)下調(diào)。

兩種損傷下，Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白家族的表達(dá)均明顯下調(diào)。Ⅱ型細(xì)胞骨架角蛋白80參與細(xì)胞分化，且對(duì)維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整是必需的，其表達(dá)在NHEK-Ad-DPE-V中下調(diào)了20%，在NHEK-Ad-DPE中下調(diào)50%。Ⅱ型細(xì)胞骨架角蛋白1（KRT1）和I型細(xì)胞骨架角蛋白10（KRT10）是角化過程中不可或缺的一對(duì)蛋白，賦予了細(xì)胞和整個(gè)表皮的機(jī)械完整性。KRT1-KRT10蛋白在兩種暴露下均出現(xiàn)下調(diào)。

4.DPE-V影響體外培養(yǎng)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的不同細(xì)胞過程：DPE-V由多種揮發(fā)性有機(jī)成分組成，會(huì)危害人皮膚，尤其是PAH及其衍生物，被認(rèn)為可以通過線粒體ROS的產(chǎn)生和隨后的線粒體損傷來誘導(dǎo)皮膚外源性老化。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，NHEK-Ad-DPE-V表現(xiàn)出獨(dú)特的參與線粒體氧化磷酸化的相互作用蛋白簇。

（1）DPE-V暴露后線粒體氧化磷酸化蛋白的表達(dá)變化：蛋白質(zhì)相互作用分析可以鑒定線粒體復(fù)合體I如NADH的蛋白組分，包括泛醌氧化還原酶亞基A7（NDUFA7）、NDUFA4、NDUFV2、NDUFS4、NDUFA2、NDUFS6、NDUFB7、NDUFS1，其過表達(dá)≥1.5倍（P≤0.05）。此外，在暴露于DPE-V的細(xì)胞中，線粒體復(fù)合物Ⅳ的組分包括細(xì)胞色素C氧化酶亞基7C（COX7C）、COX5B、COX6C、COX2、COX7A2、COX4I1、COX6B1以及泛醇-細(xì)胞色素C還原酶、復(fù)合物Ⅲ亞基X也過度表達(dá)（≥1.5倍，P≤0.05）。線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物在ROS如超氧化物、過氧化氫和羥自由基產(chǎn)生中的作用已被廣泛證實(shí)。線粒體復(fù)合物Ⅰ可以形成電子進(jìn)入氧化磷酸化的主要入口點(diǎn)，復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性增加可導(dǎo)致ROS的生成增加?？傊?，蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析揭示了參與氧化磷酸化的線粒體蛋白表達(dá)變化，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加，損傷皮膚。

（2）暴露于DPE-V對(duì)調(diào)控細(xì)胞遷移蛋白的影響：整合素是一種異二聚體的跨膜受體，參與了角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和傷口愈合。整合素α2β1已被證實(shí)是角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的必需因素。在傷口閉合過程中的遷移前沿和傷口愈合時(shí)新形成的表皮中，也已證實(shí)存在整合素α2β1的過表達(dá)。在NHEK-Ad-DPE-V中觀察到整合素β1（ITGB1）、ITGA2和ITGA3的顯著過度表達(dá)。除了整合素之外，在暴露于DPEV的細(xì)胞中還可以觀察到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白如膠原蛋白α1（Ⅶ）（COL7A1）、COL17A1和COL18A1的過度表達(dá)。COL7A1參與角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附和p38MAPK依賴性遷移。COL17A1基因敲除還與角質(zhì)形成細(xì)胞的移動(dòng)減少有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是參與ECM蛋白轉(zhuǎn)化和降解的內(nèi)肽酶。該研究的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在NHEK-Ad-DPEV中，MMP14過度表達(dá)顯著，組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP2）則表達(dá)下調(diào)。MMP14介導(dǎo)的前MMP2活化已被證實(shí)在細(xì)胞遷移和上皮傷口愈合中具有重要作用。已知TIMP2可以特異性抑制MMP14介導(dǎo)的MMP2活化。有趣的是，參與細(xì)胞遷移的蛋白質(zhì)似乎主要是在暴露于DPE-V的細(xì)胞中過表達(dá)，可能是細(xì)胞對(duì)DPE-V的防御反應(yīng)。然而，在暴露于DPE的細(xì)胞中沒有觀察到這種細(xì)胞反應(yīng)，這可能提示直接暴露于DPE對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的影響更強(qiáng)。

5.維生素E能部分修復(fù)角質(zhì)形成細(xì)胞中由DPE及DPE-V導(dǎo)致的分子水平改變：用9 IU/ml維生素E處理暴露于DPE和DPE-V的細(xì)胞，暴露于DPE-V及DPE的細(xì)胞NRF2表達(dá)均降低。兩種暴露的細(xì)胞經(jīng)維生素E處理后也會(huì)出現(xiàn)明顯聚集。蛋白組學(xué)分析顯示，維生素E處理可以使NHEKAd-DPE-V的374個(gè)表達(dá)發(fā)生變化的蛋白中約97%恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。對(duì)于NHEK-Ad-DPE，維生素E處理能使201個(gè)表達(dá)發(fā)生變化的蛋白中約61%恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。該結(jié)果表明，與暴露于DPE-V相比，直接暴露于DPE的作用更強(qiáng)。

維生素E處理可恢復(fù)參與皮膚角質(zhì)層形成、脫屑、水合作用和結(jié)構(gòu)完整性的蛋白表達(dá)水平，提示維生素E可減輕暴露于DPE和DPE-V對(duì)皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞的影響。維生素E處理還可以恢復(fù)暴露于DPE-V的細(xì)胞中線粒體復(fù)合物I和復(fù)合物IV的蛋白表達(dá)。表明維生素E等抗氧化劑對(duì)受DPE-V中氧化劑慢性影響的皮膚細(xì)胞具有保護(hù)功效。

觀察維生素E處理對(duì)NHEK-Ad-DPE-V遷移能力的影響發(fā)現(xiàn)，暴露組細(xì)胞的遷移率比對(duì)照組增加40%。因此，維生素E處理還可以部分恢復(fù)該影響。

6.角質(zhì)形成細(xì)胞中DPE及DPE-V誘導(dǎo)的表達(dá)變化分子的鑒定和維生素E的恢復(fù)作用：研究者還在兩組細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了許多發(fā)生表達(dá)變化的新蛋白。在NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中，核仁和螺旋體磷蛋白1及凋亡拮抗轉(zhuǎn)錄因子等蛋白過度表達(dá)。此外，兩組細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)了非特異性細(xì)胞毒受體蛋白1同源物等蛋白下調(diào)。維生素E處理可以使兩種細(xì)胞的這些蛋白質(zhì)水平恢復(fù)。該發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)意義尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

7.維生素E可以恢復(fù)暴露于DPE和DPE-V的細(xì)胞中涉及橋粒完整性蛋白的表達(dá)：暴露于DPE或DPE-V可以導(dǎo)致幾種與橋粒完整性有關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)，如橋粒斑蛋白、斑菲素蛋白1和corneodesmosin。這些橋粒蛋白的突變或功能喪失與多種皮膚疾病有關(guān)。維生素E處理可以使DPE和DPE-V暴露細(xì)胞中這些蛋白的大多數(shù)恢復(fù)到近似未暴露的水平。接下來，了解這些蛋白質(zhì)在皮膚生物學(xué)中的生物學(xué)意義會(huì)是有趣的工作。

總之，該蛋白組學(xué)研究強(qiáng)調(diào)了暴露于DPE和DPE-V所導(dǎo)致的分子變化的差異。直接暴露于DPE和DPE-V被證實(shí)可以改變參與維持皮膚完整性蛋白的表達(dá)水平。這些改變?cè)隗w外重建皮膚模型中也得到重現(xiàn)。在DPE和DPE-V暴露細(xì)胞中，與細(xì)胞有絲分裂周期和染色體結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白表達(dá)也明顯改變。此外，DPE-V對(duì)線粒體氧化磷酸化和細(xì)胞遷移等生物學(xué)過程具有明顯的影響。使用抗氧化劑維生素E處理，還可以部分恢復(fù)DPE和DPE-V暴露細(xì)胞中發(fā)生改變的蛋白表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了抗氧化劑在抵御空氣污染對(duì)皮膚損傷中的重要性。