結(jié)直腸癌液體活檢的臨床應(yīng)用進(jìn)展

劉鵬，劉合利

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 胃腸外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

結(jié)直腸癌（CRC）以其高發(fā)病率及高病死率嚴(yán)重危害公眾健康。根據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在所有腫瘤中，CRC的發(fā)病率和病死率分別位第三位和第二位[1]。CRC 早期階段的5年生存率為90%，但是只有39%的患者診斷時(shí)處于該階段，腫瘤累及區(qū)域淋巴結(jié)和鄰近臟器的患者下降至70.4%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率更低，僅為12.5%[2]。并且，Zheng等[3]分析大量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)超過80%的轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）患者在臨床上未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的證據(jù)時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此對(duì)CRC進(jìn)行早期診治成為提高CRC患者生存率的關(guān)鍵。目前臨床上對(duì)于CRC的確診及其分子特征鑒定主要依靠組織活檢，通常是從原發(fā)性腫瘤或單個(gè)轉(zhuǎn)移病灶中獲得組織來進(jìn)行確診，再鑒定其分子特征，隨后根據(jù)分子特征制定相關(guān)治療措施[4]。但是該方法也存在局限性，比如：⑴ 組織活檢反映的是腫瘤某一時(shí)間位點(diǎn)的情況，沒有考慮腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的空間異質(zhì)性及時(shí)間異質(zhì)性，很難準(zhǔn)確反映腫瘤完整基因圖譜；⑵ 組織活檢屬于侵入性檢查，有相關(guān)的并發(fā)癥及活檢禁忌證，患者安全性難以得到保障；⑶ 對(duì)于保存時(shí)間較長(zhǎng)的組織樣本進(jìn)行檢測(cè)無法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)二次耐藥的產(chǎn)生及其機(jī)制，因?yàn)槟[瘤在治療過程中，特別是進(jìn)行靶向治療時(shí)其分子特征可以繼發(fā)突變[5-10]。

液體活檢是指通過對(duì)患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，CtDNA）、外泌體（exosomes）及腫瘤血小板（tumor-educated platelets，TEPs）等進(jìn)行提取檢測(cè)，使臨床醫(yī)生能夠反復(fù)多次及非侵入性地對(duì)患者腫瘤情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)了解，達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)療的目的[11]。除血液外，尿液、唾液、胸腔積液以及糞便中已被證明含有腫瘤組織的遺傳物質(zhì)[4]。許多臨床研究已經(jīng)證實(shí)對(duì)腫瘤患者進(jìn)行液體活檢能夠確定患者腫瘤分子特征、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和微小殘留病灶以及評(píng)估對(duì)治療的耐藥性。本文將對(duì)目前應(yīng)用較為廣泛的液體活檢方法進(jìn)行敘述，以加深臨床醫(yī)生對(duì)液體活檢的理解，提高臨床診治能力。

1 CTC

CRC患者的預(yù)后主要取決于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。CTC是指從原發(fā)腫瘤和/或轉(zhuǎn)移灶主動(dòng)或被動(dòng)脫落進(jìn)入血管內(nèi)的一種腫瘤細(xì)胞[4]。目前在臨床上可以從腫瘤患者的血液中分離出CTC，包括單個(gè)細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)，具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，并且相關(guān)研究已經(jīng)證明從患者血液檢測(cè)到的CTC的數(shù)量與患者的預(yù)后及生存率具有明顯相關(guān)性[10-11]。但是，血液中CTC的數(shù)量很少，在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中，每109個(gè)血細(xì)胞中約有1個(gè)CTC，而且在不同的腫瘤類型之間存在差異[12]。由于血液中CTC的數(shù)量較少，不能直接用于檢測(cè)，因此必須對(duì)CTC進(jìn)行富集提取再進(jìn)行相關(guān)分析。

提取血液中的CTC可以通過基于細(xì)胞直徑大小和其它生物物理特性的負(fù)性富集來進(jìn)行分離，也可以通過使用CTC表面的細(xì)胞標(biāo)志物如上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）進(jìn)行正性富集來進(jìn)行分離[13]。但是目前仍舊缺乏能夠區(qū)分CTC與非惡性上皮細(xì)胞的標(biāo)記，并且，由于腫瘤細(xì)胞直徑大小相差較大，基于細(xì)胞直徑的提取方法會(huì)導(dǎo)致大量CTC的丟失[4]。目前，唯一一個(gè)經(jīng)FDA批準(zhǔn)的在轉(zhuǎn)移性CRC患者中分離和計(jì)數(shù)CTC的平臺(tái)是CellSearch，是目前國際上最為穩(wěn)定和可靠的CTC檢測(cè)系統(tǒng)。該平臺(tái)根據(jù)上皮細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM的表達(dá)和白細(xì)胞特異分子CD45的缺乏表達(dá)對(duì)CTC進(jìn)行陽性選擇[14]。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌和前列腺癌患者中，每7.5 mL血液中CTC≥5個(gè)是無進(jìn)展生存期（progressionfree survival，PFS）降低的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因素，而＜5個(gè)CTC是總生存期（overall survival，OS）提高的預(yù)測(cè)因素[15-16]，但是對(duì)于轉(zhuǎn)移性CRC患者來說，預(yù)測(cè)閾值為≥3 CTC/7.5 mL（PFS）和＜3 CTC/7.5 mL（OS）[17]。

1.1 CTC 的臨床應(yīng)用

1.1.1 腫瘤早期診斷與篩查 由于CRC 患者早期癥狀不典型，早期篩查主要依靠糞便隱血試驗(yàn)及腫瘤標(biāo)志物等相關(guān)檢查，但其敏感性和特異性均有限。楊平等[18]通過檢測(cè)60 例不同分期的CRC患者以及30 例直腸良性疾病患者外周血CTC 的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CRC 患者外周血CTC 的陽性率明顯高于良性疾病對(duì)照組，并且發(fā)現(xiàn)IV 期CRC 患者CTC 的陽性率顯著高于II～I(xiàn)II 期患者，提示外周血CTC 的數(shù)量與患者疾病的臨床進(jìn)展和臨床分期有關(guān)。因此可以通過早期檢測(cè)CTC 水平篩選出CRC 高危人群以提高CRC 的早期診斷率。

1.1.2 監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移 近年來，CTC 與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。Tien 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)13 例門靜脈CTC 計(jì)數(shù)較高的患者中有11 例患者在術(shù)后6 個(gè)月內(nèi)發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，相反，47 例門靜脈CTC 計(jì)數(shù)較低的患者中只有6 例發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，因此可以認(rèn)為門靜脈血中CTC 數(shù)量可以作為術(shù)后6 個(gè)月內(nèi)肝轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測(cè)因素。Huang 等[20]的一項(xiàng)Meta 分析統(tǒng)計(jì)分析了11 項(xiàng)研究包含1847 例CRC 患者外周血CTC 的相關(guān)數(shù)據(jù)，也發(fā)現(xiàn)mCRC 患者的外周血CTC 的數(shù)量較未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者顯著升高。因此檢測(cè)腫瘤患者外周血CTC 的數(shù)量可以幫助監(jiān)測(cè)患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。

1.1.3 評(píng)估腫瘤患者預(yù)后 通過檢測(cè)CRC 患者術(shù)前以及術(shù)后外周血CTC 數(shù)量及其兩者之間的變化情況可以有效地判斷患者的手術(shù)預(yù)后情況。一項(xiàng)Meta 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)CRC 患者術(shù)前外周血CTC 的數(shù)量將其分為2 組，分別為CTC 高數(shù)量組和CTC 低數(shù)量組，相較于CTC 高數(shù)量組，低數(shù)量組患者疾病控制率更好（P=0.048），OS 和PFS 更長(zhǎng)（P＜0.001）；進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)，術(shù)后CTC 由低數(shù)量組轉(zhuǎn)變?yōu)楦邤?shù)量組和由高數(shù)量組轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛿?shù)量組相比，OS（P＜0.001）和PFS（P=0.023）更短[21]。Tsai 等[22]也發(fā)現(xiàn)，若術(shù)后患者血清中CTC 計(jì)數(shù)≥5 個(gè)，其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率是CTC＜5 個(gè)的患者的8 倍，并且無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）也更短。此外，Bork 等[23]的研究也顯示手術(shù)前CTC 數(shù)量是患者獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

1.1.4 評(píng)估化療效果 臨床上判斷晚期腫瘤患者治療療效主要是根據(jù)基于測(cè)量病灶大小的RECIST療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但不是所有經(jīng)過治療好轉(zhuǎn)的患者病灶都會(huì)縮小，部分患者病灶會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的變化比如囊性變，因此僅僅依靠RECIST 標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)患者情況有局限性。而CTC 聯(lián)合傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)則可以更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)患者的療效及預(yù)后。Huang 等[21]的Meta分析比較了化療對(duì)CTC 高數(shù)量組和低數(shù)量組的影響差異，CTC 低數(shù)量組化療后中位無疾病進(jìn)展期和中位疾病進(jìn)展期分別為21.7 個(gè)月和7.9 個(gè)月，而CTC 高數(shù)量組中位無疾病進(jìn)展期和中位疾病進(jìn)展期分別為9.6 個(gè)月和3.3 個(gè)月，兩組療效的差異提示CRC 患者CTC 的數(shù)量與化療療效之間有顯著相關(guān)性。因此，除傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查CT、MRI 之外，外周血CTC 計(jì)數(shù)可以作為判斷化療效果的補(bǔ)充性指標(biāo)，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)化療過程中CTC 數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化判斷化療效果，及時(shí)調(diào)整化療方案[24]。Abdallah 等[25]研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)mCRC 患者外周血CTC 中胸苷酸合成酶的變化可以作為預(yù)測(cè)5-氟尿嘧啶耐藥生物標(biāo)志物的輔助工具。Khoo 等[26]通過體外培養(yǎng)CTC 觀察到CTC 形成簇集的可能性與藥物濃度增加呈負(fù)相關(guān)，簇集形成所需藥物濃度的增加可能預(yù)示著耐藥性的產(chǎn)生，為臨床醫(yī)師早期對(duì)患者進(jìn)行干預(yù)或及時(shí)調(diào)整干預(yù)措施提供了希望。

除此之外，提取腫瘤患者血液中的CTC還可用來檢測(cè)藥物靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)可以檢測(cè)乳腺癌患者CTC表面的PD-L1表達(dá)情況明確患者全身情況，將液體活檢與免疫治療聯(lián)系起來，為免疫治療在腫瘤中的應(yīng)用提供了一種新途徑[4]。與CtDNA僅檢測(cè)游離的腫瘤DNA碎片相比較，CTC可利用完整的腫瘤細(xì)胞信息，更好的反映腫瘤在機(jī)體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況[27]。并且，對(duì)分離出來的CTC還可以進(jìn)行核酸水平、蛋白質(zhì)水平及分子水平的后續(xù)檢測(cè)，進(jìn)一步指導(dǎo)后續(xù)臨床工作。

2 CtDNA

循環(huán)無細(xì)胞DNA（cell-free DNA，CfDNA）是由正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞等凋亡壞死后釋放到血管中的游離DNA片段，通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核小體游離于全身血液循環(huán)中[28]。CfDNA一旦進(jìn)入外周循環(huán)，半衰期很短，很快就會(huì)通過腎臟、肝臟和脾臟等迅速從體內(nèi)清除[4]。因此，CfDNA可以實(shí)時(shí)反映機(jī)體全身情況。腫瘤患者血液中的CfDNA包括非腫瘤來源的DNA和腫瘤來源的DNA，后者又被稱為CtDNA，可能來源于原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移灶或CTC，其基因圖譜與相應(yīng)腫瘤的基因圖譜非常匹配，能夠真實(shí)可靠的反映患者的腫瘤信息[4,12]。CfDNA中絕大部分為非腫瘤來源DNA，而CtDNA的濃度很低[4]。通過以往的研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)CtDNA在CfDNA中的占比在10%或以上時(shí)，才能得到準(zhǔn)確的腫瘤信息[29]?？梢酝ㄟ^加大測(cè)序深度來提高CtDNA檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率，但是有研究已經(jīng)證實(shí)許多良性病變與惡性腫瘤有著相似甚至相同的突變，因此提高檢測(cè)的靈敏度可能會(huì)帶來假陽性的結(jié)果，從而導(dǎo)致過度診療[30]。CtDNA反映的是從同個(gè)腫瘤病灶多個(gè)區(qū)域或不同腫瘤病灶釋放的DNA，可以評(píng)估腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性及檢測(cè)到亞克隆突變，以提供對(duì)腫瘤基因組的全面觀察[31]。CtDNA的定量分析可以用于評(píng)估腫瘤負(fù)荷，因?yàn)槟[瘤患者血漿中CtDNA含量明顯高于健康人或良性疾病患者，并且隨著腫瘤的分期的增加，CtDNA含量上升[32]。

2.1 CtDNA 的臨床應(yīng)用

2.1.1 CRC的篩查與診 斷 Bettegowda 等[33]通過PCR技術(shù)和二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)對(duì)640 例不同類型的腫瘤患者包括CRC 進(jìn)行了分析；在晚期腫瘤患者中有75% 的患者外周血檢測(cè)到了突變的CtDNA，而早期腫瘤中不到50% 的患者檢測(cè)到突變CtDNA，提示ctDNA 的檢出率與腫瘤負(fù)荷相關(guān)；該試驗(yàn)也證實(shí)了CtDNA 檢出率與分期也有關(guān)：47% 的I 期腫瘤患者能夠檢測(cè)出ctDNA，而II、III 和IV 期腫瘤患者的CtDNA 檢出率分別為55%、69% 和82%。Yang 等[34]研究也證實(shí)IV 期CRC 患者外周血的CtDNA 濃度顯著高于I 期患者并且CtDNA 濃度增加與腫瘤大小增加相關(guān)，提示高濃度的CtDNA 與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，并且該研究也顯示了與臨床上常用的生物標(biāo)記物如CEA、CA19-9 相比，CtDNA 的檢出率比較高，提示CtDNA 對(duì)CRC 的篩查比腫瘤標(biāo)志物效果要好。Boni 等[35]的研究表明CtDNA 在腸癌患者中的水平明顯高于正常人群，且腫瘤分期越晚，CtDNA 血清濃度越高。將癌胚抗原與CtDNA 聯(lián)合作為早期篩查的腫瘤標(biāo)志物，單個(gè)指標(biāo)陽性的敏感性增加至88%，特異性為70.7%，兩者均陽性時(shí)疾病診斷特異性可達(dá)100%[36]。

2.1.2 療效判斷 已經(jīng)有相關(guān)研究證明CtDNA 具有預(yù)后評(píng)估價(jià)值，在非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者經(jīng)過手術(shù)治療或化療后，外周血仍檢測(cè)得到CtDNA 對(duì)患者來說是復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)指標(biāo)[37]。并且通過檢測(cè)血液中CtDNA 的腫瘤特異性變化，還可以檢測(cè)出微小殘留病灶，并預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的復(fù)發(fā)情況[38]。Symonds 等[39]在對(duì)91 例CRC 患者手術(shù)前后血液樣本的分析中發(fā)現(xiàn)，47 例患者在診斷時(shí)具有CtDNA 陽性，35 例（74.5%）在腫瘤切除后轉(zhuǎn)為陰性。Diehl 等[40]的研究發(fā)現(xiàn)CtDNA 在所有患者術(shù)前均能檢測(cè)到，而連續(xù)血液取樣顯示CtDNA 水平與手術(shù)切除程度有關(guān)。Cheng 等[41]的研究也顯示CtDNA 既可以用來判斷腫瘤是否切除徹底，又可以判斷藥物治療是否有效。在許多腫瘤中，與抑癌基因相關(guān)的特定區(qū)域CpG 島啟動(dòng)子高度甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因此，CtDNA 的甲基化是一種很有前途的生物標(biāo)志物[4]。有相關(guān)研究比較了腫瘤組織中的異常的甲基化和血液樣本中匹配的CtDNA，相關(guān)性較好[42]。Murray 等[43]在CRC 患者手術(shù)12個(gè)月內(nèi)測(cè)定CtDNA 的BCAT1 和IKZF1 甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)甲基化陽性的患者殘留微小病灶和術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。除此之外，David 等[44]的一項(xiàng)研究將液體活檢與免疫治療聯(lián)系起來了。研究人員將液體活檢測(cè)得的bTMB 和通過組織樣本測(cè)得的TMB 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者在整體上呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，后又發(fā)現(xiàn)bTMB 的大小能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)免疫治療的療效。

2.1.3 對(duì)治療耐藥的預(yù)測(cè) 液體活檢也被成功應(yīng)用于確定mCRC 患者對(duì)EGFR 抑制劑的耐藥機(jī)制。在接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療6 個(gè)月后，將近40% 的患者血漿中可檢測(cè)到高水平的KRAS 突變，而在開始治療前獲得的組織活檢標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)該基因任何突變，并且，可以比影像學(xué)檢查提前10 個(gè)月證實(shí)疾病進(jìn)展[6,45]。在轉(zhuǎn)移性CRC 和對(duì)EGFR 抑制劑繼發(fā)性耐藥患者的血漿CtDNA 中也檢測(cè)到met 擴(kuò)增[46]。因此，對(duì)患者血液CtDNA 進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以明確機(jī)體耐藥情況，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整治療措施，使患者獲得最大的臨床效益。

2.1.4 預(yù)后評(píng)估 Thomsen 等[47]在對(duì)138 例 接受標(biāo)準(zhǔn)一線治療的mCRC 患者的研究中發(fā)現(xiàn)，第一輪化療后低水平的CtDNA 與疾病進(jìn)展低風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，在治療過程中任何時(shí)間CtDNA 的顯著增加都預(yù)示著疾病進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)。Yao 等[48]報(bào)道了RAS/BRAF 突變的CtDNA 檢測(cè)可預(yù)測(cè)mCRC 一線化療患者PFS 的惡化，為RAS/BRAF CtDNA 突變檢測(cè)在mCRC 患者中的預(yù)后價(jià)值提供依據(jù)。原則上，液體活檢方法可能非常適合測(cè)量微小殘留病灶（Minimal residual disease，MRD）。在一項(xiàng)研究中，Diehl 等[40]使用BEAMing（珠乳擴(kuò)磁技術(shù)）方法測(cè)定CRC 患者CfDNA 中低達(dá)0.01% 的突變頻率，檢測(cè)結(jié)果呈陽性的患者通常在局部手術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)。最近，Tie 等[37]報(bào)道了一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)評(píng)估了II 期CRC 患者術(shù)后CtDNA水平與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系，術(shù)后CtDNA 檢測(cè)到的患者的復(fù)發(fā)率是檢測(cè)不到的患者的10 倍以上。

由于CtDNA的假陽性率低、半衰期短、靈敏度高、數(shù)量較CTC多等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其更適合成為腫瘤生物學(xué)指標(biāo)。因此，也有越來越多有關(guān)于CtDNA的研究正在進(jìn)行。最近有一項(xiàng)里程碑式的研究證明了CtDNA具有一定的長(zhǎng)度特征。該研究通過將344份腫瘤患者血漿樣本與65例健康人的血漿樣本進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，健康人與腫瘤患者的CfDNA在90～150 bp、180～220 bp和250～320 bp之間的分布都有所不同，當(dāng)他們將這些CfDNA測(cè)序后還發(fā)現(xiàn)帶有腫瘤突變的CtDNA片段普遍比核小體DNA片段（167 bp）短20～40 bp，在90～150 bp區(qū)間富集，說明可以通過富集短片段的方法提高CtDNA的濃度，進(jìn)而能提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度[49]。研究者繼續(xù)用片段選擇性測(cè)序法檢測(cè)腫瘤患者的疾病進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)能夠比影像學(xué)檢查提前60 d檢測(cè)到腫瘤進(jìn)展，而能夠比未經(jīng)片段選擇的液體活檢提前89 d[49]。不僅如此，研究者重新用兩種液體活檢方法對(duì)另一隊(duì)列的48份腫瘤患者的血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，與已知結(jié)果相比，兩者的準(zhǔn)確率分別為82%和50%[49]?？梢姡ㄟ^片段選擇性液體活檢能夠大大提高液體活檢的準(zhǔn)確性，更適用于臨床應(yīng)用。

盡管CtDNA對(duì)臨床的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)越發(fā)明顯，但也有許多問題需要進(jìn)一步解決[4]，比如：1）患者血液采集程序的標(biāo)準(zhǔn)化問題；2）如何提高樣本在室溫下的穩(wěn)定性，從而有效降低分析前ctDNA的變異；3）明確CtDNA定量方法的標(biāo)準(zhǔn)，以提高靈敏度及準(zhǔn)確性。

3 循環(huán)腫瘤RNA 及外泌體檢測(cè)

miRNA是血液中含量最豐富的cfRNA分子，可以被外泌體、凋亡小體、蛋白質(zhì)-miRNA復(fù)合物和腫瘤血小板（TEPs）所攜帶。外泌體是一種30～150 nm的雙層膜囊泡，血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血小板和平滑肌細(xì)胞都能釋放外泌體[50-51]。外泌體中包含蛋白質(zhì)以及DNA、mRNA和miRNA等核酸，在細(xì)胞間進(jìn)行信息交換和調(diào)節(jié)受體細(xì)胞活動(dòng)[52-53]。腫瘤來源的外泌體可以調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境、增強(qiáng)腫瘤侵襲能力，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[54]。目前可以通過常規(guī)密度梯度離心法從體液中提取外泌體，也可以通過超速離心、透射顯微鏡觀察或根據(jù)特定蛋白標(biāo)記物來分離外泌體[55]。從生物體液中收集到的外泌體可以分離和隨后分析mRNA，從而檢測(cè)突變、剪接變異和基因融合，以及基因表達(dá)譜分析[56]。因與腫瘤相關(guān)的外泌體包含有腫瘤相關(guān)信息，因此外泌體是一種潛在的腫瘤生物標(biāo)志物。

檢測(cè)外泌體中的mRNA與檢測(cè)來自腫瘤細(xì)胞的CtDNA片段相比，mRNA可能來自一個(gè)高表達(dá)基因并且含有大量拷貝，并且可以以較高的濃度進(jìn)入血液循環(huán)，因此，對(duì)于血液中CtDNA片段較少甚至無法檢測(cè)到的患者來說，對(duì)外泌體中的mRNA進(jìn)行分析比較有優(yōu)勢(shì)[4]。多項(xiàng)試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)外泌體包含的miRNA及蛋白質(zhì)組分的敏感性及特異性明顯高于目前臨床上應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9。Ogata等[57]分析對(duì)比了CRC患者與健康人群血清中16 種外泌體來源的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中7種mRNA（miR-21、let-7a、miR-23a、miR-1229、miR-150、miR-1246、miR-223）的含量在CRC患者血清中顯著升高，并且在經(jīng)過手術(shù)治療后這些miRNA 在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平明顯下降，不僅如此，通過miR-23a和miR-1246篩查早期CRC患者的敏感性分別為95%、90%。另一項(xiàng)研究表明，外泌體來源的miR-200家族表達(dá)缺失，將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易侵入血管及淋巴管，并且在5-FU耐藥的細(xì)胞系中同樣觀察到外泌體分泌的miR-200家族表達(dá)水平下降，提示外泌體miR-200家族的缺失，將導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加，更易耐藥[58]。

4 TEPs

TEPs 作為一種新興的液體活檢，可用于泛腫瘤分析、區(qū)分腫瘤類型以及腫瘤基因突變的診斷。Best等[59]通過對(duì)283份血小板樣本的mRNA序列進(jìn)行測(cè)定，能夠區(qū)分228例局限性或者轉(zhuǎn)移性腫瘤及健康體檢者，準(zhǔn)確率高達(dá)96%，不僅如此，TEPs還能區(qū)分及定位6種不同的腫瘤類型，其判斷原發(fā)腫瘤位置的準(zhǔn)確率達(dá)71%。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，液體活檢技術(shù)在CRC 及其它腫瘤種得到了廣泛研究及應(yīng)用，能夠?yàn)槟[瘤患者提供更精準(zhǔn)的治療措施，使患者獲得最佳的臨床受益。盡管如此，但液體活檢仍面臨著許多挑戰(zhàn)，尚處于臨床試驗(yàn)階段，需進(jìn)行大規(guī)模的前瞻性臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。相信液體活檢能夠更加精準(zhǔn)地為患者帶來希望。