核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素生物合成途徑關鍵基因研究進展

郭永翠，秦江南，張 銳

（1塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆阿拉爾；3南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，新疆阿拉爾）

研究表明，核桃內(nèi)果皮的主要組分是木質(zhì)素（Lignin）[3]，木質(zhì)素是陸生維管植物適應環(huán)境的進化特征之一，同時也是構成其細胞壁的主要成分之一，主要存在于植物木質(zhì)化程度高的硬組織中與纖維素、半纖維素等多糖分子通過氫鍵、共價鍵等作用相互交聯(lián)在一起，通常起到增強細胞壁的沉積、提高細胞壁機械強度及硬度的作用，具有較強的不滲水性，對病原體具有保護的作用[4]，其穩(wěn)定性較高從而使得植物細胞壁具有抗氧化、阻燃、機械支持及生物防御等功能。木質(zhì)素的物理及化學性質(zhì)也使得植物體具有防止蟲害和病原體侵入的作用。植物體木質(zhì)素生物合成途徑及調(diào)控是一個復雜的過程，目前關于木質(zhì)素單體合成途徑已基本清晰，但木質(zhì)素聚合機理仍未系統(tǒng)闡述清楚。本文從木質(zhì)素結構、木質(zhì)素生物合成過程及基因調(diào)控規(guī)律等方面分析基因調(diào)控規(guī)律，以期從分子育種途徑調(diào)節(jié)核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素生物合成途徑中關鍵基因，為進一步改良核桃果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 核桃內(nèi)果皮研究

核桃由內(nèi)果皮（硬殼）和種仁組成，內(nèi)果皮作為核桃重要組成部分，具有比表面積和孔隙率大、機械強度高、可再生和降解等優(yōu)點，在核桃果實發(fā)育、加工及貯藏中均起著重要作用。目前對核桃內(nèi)果皮結構（縫合線緊密度、厚度、機械強度）與種仁商品品質(zhì)的關系研究較多，及內(nèi)果皮做吸附劑吸附重金屬獲染料的研究較多[5-7]。

研究表明，核桃內(nèi)果皮最主要組分為木質(zhì)素（GS型木質(zhì)素，其中G型木質(zhì)素高達80.68%），內(nèi)果皮越厚核桃縫合線越緊密，且硬殼厚度與堅果質(zhì)量存在極顯著的正相關關系，與出仁率存在極顯著的負相關關系[8-9]。近年來通過研究核桃內(nèi)果皮（包括核桃殼粉）對Cu2+、As3+、Cr6+、Pb2+等金屬離子分別進行直接吸附、活性吸附劑等吸附試驗，發(fā)現(xiàn)通過物理化學方法活化后吸附量比直接做吸附劑的效果好，其吸附性均對金屬離子均具有選擇吸附性[10-13]。

2 木質(zhì)素結構

木質(zhì)素是具復雜三維網(wǎng)狀芳環(huán)結構的酚類高分子聚合物，是一種珍貴難降解的天然可再生資源且含量高[14，15]。其相對含量達生物質(zhì)的1/3左右且能量最高。通過氫鍵、酯鍵、醚鍵、范德華力等共價鍵與非共價鍵的共同作用，與纖維素、半纖維素連接并交織在形成復合體，在植物中起到抵抗壓力、硬化細胞壁、增強植物體的機械強度的作用，但很難造成分離純化木質(zhì)素[16，17]。

木質(zhì)素是植物體內(nèi)含有大量醇羥基、酚羥基、羰基等活性基團的復雜天然大分子，其含碳60%、氧30%、氫6%及氮0.67%左右，同時具備糖及酚的特點，因此反應類型十分豐富，能與不同物質(zhì)發(fā)生不同化學反應。木質(zhì)素主要由對-羥基苯基木質(zhì)素（，H-木質(zhì)素）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G-木質(zhì)素）和紫丁香基木質(zhì)素（，S-木質(zhì)素）3種木質(zhì)素單體亞單位構成，分別來自香豆醇（）、松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（）3種苯丙烷。其中香豆醇結構中沒有甲氧基基團，芥子醇比松柏醇多了一個甲氧基基團且芥子醇無游離的C-5，導致不能與其它單體形成較穩(wěn)定的C-C連接，因此S-木質(zhì)素結構疏松在木質(zhì)素分離時較G和H型木質(zhì)素易被去除。通常20多種化學鍵連接在一起構成木質(zhì)素單體，隨著木質(zhì)素相關研究的深入，發(fā)現(xiàn)植物體木質(zhì)素的構成不僅由這3種木質(zhì)醇組成，還有木質(zhì)醇的不完全生物合成過程中生成的5-羥基松柏醇、羥基肉桂醛、羥基肉桂酸等單體也參與了木質(zhì)素的聚合過程，且在植物中發(fā)現(xiàn)錳過氧化物酶（MnP）、漆酶（L）、漆酶 /木聚糖酶體系（LXS）、漆酶 /介體體系（LMS）等可直接降解木質(zhì)素[18，19]。

3 木質(zhì)素生物合成途徑

木質(zhì)素生物合成途徑通常由羥基化、連接反應、甲基化、氧化還原反應、聚合反應等復雜過程交互完成，由于植物自身發(fā)育、外界環(huán)境的影響，加之一些未知酶或基因對木質(zhì)素生物合成造成影響或修正原有功能及作用，目前木質(zhì)素基本合成過程中木質(zhì)素單體的合成、貯藏、運輸及木質(zhì)素單體脫氫羥化聚合為木質(zhì)素的過程還不是完全清楚。經(jīng)過木質(zhì)素方面多年的研究基礎，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素單體生物合成途徑首先是二氧化碳在植物光合作用下產(chǎn)生的葡萄糖經(jīng)酶促反映生成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的莽草酸途徑，這是植物體、細菌及真菌特有的代謝途徑；其次是苯丙氨酸經(jīng)過脫氨基、甲基化、羥基活化等過程到反式-4-羥基肉桂酸（HCA）及其輔酶A脂類化合物的苯丙烷代謝途徑；最后是對羥基肉桂酸（HCA）及其輔酶A脂類化合物氧化還原為木質(zhì)素單體，再進一步強化脫氫聚合生成木質(zhì)素的木質(zhì)素合成特異途徑[20]。

4 木質(zhì)素合成途徑中關鍵調(diào)控基因

木質(zhì)素生物合成途徑及其調(diào)控過程復雜，根據(jù)其途徑中關鍵酶調(diào)控效果可分為3類：（1）苯丙烷代謝途徑調(diào)控基因，主要由PAL（苯丙烷類代謝途徑首個限速酶）、C4H（細胞中起結構支架作用的單氧化酶）及4CL（連接木質(zhì)素前體及各個分支反應的關鍵酶）參與調(diào)控；（2）木質(zhì)素特異合成途徑上游基因調(diào)控，主要由C3H（控制木質(zhì)素代謝過程H-單體向G/S-單體轉化的關鍵酶）、COMT（參與C5位置甲基化的重要甲基化酶）、CCoAOMT（參與芳香環(huán)上羥基的甲基化酶）、F5H（CYP84家族決定S-木質(zhì)素前體的限速酶）參與調(diào)控；（3）木質(zhì)素單體特異合成途徑下游基因調(diào)控，下游調(diào)控基因由CCR（控制木質(zhì)素合成及微纖夾角）和CAD（木質(zhì)素生物合成中最后一步關鍵催化反應酶）組成。

4.1 苯丙烷代謝途徑調(diào)控基因

PAL存在于多數(shù)綠色植物和少數(shù)細胞細菌、真菌和藻類中，在植物體內(nèi)苯丙烷代謝途徑中催化苯丙氨酸脫氨生成氨和反式肉桂酸，對細胞分化、木質(zhì)化過程、抗旱、抗寒、抗病蟲害等方面均起到重要作用[21]。Korth等在轉基因煙草中上調(diào)PAL基因，木質(zhì)素含量及PAL的活性均增加[22]；鄒麗紅等在砂梨研究中抑制PAL活性降低了木質(zhì)素含量及石細胞含量，但并未改良砂梨果品品質(zhì)[23]。C4H是細胞色素P450家族CYP亞家族中的一種單氧化酶，在細胞中起著結構支架的作用，Sewalt等對轉基因煙草研究中發(fā)現(xiàn)抑制C4H表達會導致植物體內(nèi)S/G值下降，木質(zhì)素含量出現(xiàn)降低同時其構成改變，但植株生長正常未出現(xiàn)異常[24]；Blee K等在煙草研究發(fā)現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)抑制植株中C4H活性，S/G比值出現(xiàn)顯著降低且木質(zhì)素的含量明顯下降，植物生長正常未出現(xiàn)異常[25]。通過對4CL序列分析發(fā)現(xiàn)4CL基因主要從玉米、水稻等單子葉植物和擬南芥、煙草等雙子葉植物中被克隆出來，隨后研究發(fā)現(xiàn)4CL在植物體內(nèi)主要以基因家族的形式存在，位于苯丙烷類及其衍生物生物合成的關鍵點上[26-27]。倪志勇等在擬南芥、煙草、白楊、毛白楊等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制4CL基因表達會引起植物體內(nèi)木質(zhì)素含量顯著降低，其中S/G比值卻會根據(jù)植物種類的不同而有所差異，在擬南芥植株中G-木質(zhì)素的含量顯著降低，在煙草植株中S-木質(zhì)素的含量顯著降低，而在白楊中植株S/G卻沒有明顯變化[28,29]。綜上所述，下調(diào)這4種酶活性或抑制基因表達，植株體內(nèi)木質(zhì)素含量顯著降低。

4.2 木質(zhì)素特異合成途徑上游基因調(diào)控

C3H是細胞色素P450 CYP98A3基因家族之一，在植物木質(zhì)素代謝過程中主要調(diào)控H單體向G、S單體轉化[30]。Reddy等對苜蓿反義抑制研究中發(fā)現(xiàn)降低C3H活性木質(zhì)素含量沒有明顯變化，但H單體相較G、S單體其含量顯著增加[31]；Coleman等研究發(fā)現(xiàn)降低C3H基因表達，S/G比值也顯著增加（木質(zhì)素總含量顯著下降）[32]；Ralph J等降低白楊中C3H基因表達，木質(zhì)素總量降低為原來的一半，其中G-木質(zhì)素和S-木質(zhì)素含量均下降，但是原本含量較低的H-木質(zhì)素則顯著增加的現(xiàn)象[33]。COMT植物體內(nèi)主要起到合成和調(diào)控S-型木質(zhì)素的作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，抑制玉米[34]、銀合歡[35]、紫花苜蓿[36]等植物中COMT活性，木質(zhì)素含量均出現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象。Lapierre等研究轉基因白楊、高羊茅等植物發(fā)現(xiàn)，調(diào)控COMT一般只影響S/G比值，木質(zhì)素含量變化不明顯，只有在高水平抑制表達時才能起到降低木質(zhì)素總含量的作用[34-38]。CCoAOMT比COMT發(fā)現(xiàn)的晚些，主要參與S/G-型木質(zhì)素的合成及調(diào)控作用[39]。最早對擬南芥[40]、苜蓿[41]等植物研究發(fā)現(xiàn)，抑制CCoAOMT的表達木質(zhì)素含量明顯降低同時其組分發(fā)生改變；在抑制甜蕎[42]、桉樹[43]等植物中CCoAOMT基因的表達，能顯著降低木質(zhì)素含量，其中甜蕎中CCoAOMT基因表達量與木質(zhì)素含量呈顯著正相關；在亞麻[44]、楊樹[45]等植物中抑制CCoAOMT基因的表達，木質(zhì)素含量不僅降低同時伴有植株生長畸形、木質(zhì)部結構發(fā)生變化等現(xiàn)象。其中反義共轉化COMT、CCoAOMT基因表達，使轉基因煙草植株木質(zhì)素含量下降幅度更大，說明存在協(xié)同效應及交叉作用。F5H在植物體中起限制S-型木質(zhì)素合成的作用，通過調(diào)控F5H基因的表達雖然不能起到降低木質(zhì)素總含量的作用，但過量表達F5H基因導致S-型木質(zhì)素單體含量增加（S/G比值增大），使的木質(zhì)素更易于從植物體內(nèi)去除。調(diào)控上述3種酶活性不僅起到降低植物木質(zhì)素含量的作用且起到改變木質(zhì)素組分的作用。

4.3 木質(zhì)素單體特異合成途徑下游基因調(diào)控

CCR催化3種羥基肉桂酸輔酶A酯生成相應肉桂醛，緊接著CAD通過NADPH將3種肉桂醛通過氧化還原反應催化生成3種對應的肉桂醇，對其展開的相關研究相對較早。Relph等（1998）研究發(fā)現(xiàn)，抑制CCR的表達使植物體內(nèi)木質(zhì)素總含量顯著下降，且組分會發(fā)生相應改變[46]。研究發(fā)現(xiàn)降低轉基因楊樹（Populus tremula×Populus alba）[47]、玉米[48]、黑麥草[49]中CCR的活性，植株中木質(zhì)素總體含量將會降低甚至到原來含量的一半，植株的表型出現(xiàn)異常且生長活力不足。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥[50]、楊樹[51]、甜蕎[42]等植物中降低CAD基因的表達量往往伴隨著木質(zhì)素含量降低或影響木質(zhì)素單體的組成，植株表現(xiàn)型通常正常。

5 木質(zhì)素研究問題與展望

通過近年來的不斷探索目前已研究開發(fā)出上百種的木質(zhì)素產(chǎn)品，但是由于木質(zhì)素結構復雜多變、化學成分尚不完全清楚、化學性質(zhì)極不穩(wěn)定等因素制約，我們對木質(zhì)素的空間結構和代謝途徑了解還不透徹，目前只有少數(shù)植物中的木質(zhì)素建立了結構模型，可能還有很多與木質(zhì)素相關的基因沒有被發(fā)現(xiàn)，關于核桃露仁現(xiàn)象及與之相關核桃內(nèi)果皮硬化過程中木質(zhì)素沉積的系統(tǒng)分子機理尚不清楚，如何深挖露仁核桃資源在生產(chǎn)加工、遺傳育種上的應用潛能，加強新疆特有露仁核桃種質(zhì)資源的保存與保護，深層次發(fā)揮露仁優(yōu)良基因在新疆高品質(zhì)露仁核桃育種中的實踐價值，是當前核桃育種基礎研究和生產(chǎn)實踐中亟需解決的問題。通過克隆得到木質(zhì)素生物合成途徑中關鍵基因并加以調(diào)控，從而起到改變植物體木質(zhì)素含量及其組分的相關研究也成為近幾年研究的熱點。在基因調(diào)控方面，人們在不同植物克隆并獲得木質(zhì)素含量改變植株，目前核桃（Juglans regia）全基因組測序已完成[52]，深入研究核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素代謝途徑相關基因的功能、核桃硬核期基因調(diào)控方面提供理論基礎，可以為今后開展核桃遺傳圖譜構建、分子標記輔助選擇和品質(zhì)改良、重要性狀基因的克隆與功能驗證等分子育種工作打好基礎。