華蟾酥毒基通過(guò)FAK/PI3K/Akt通路抑制食管癌Kyse-520細(xì)胞遷移和侵襲

盛杰霞，鄧 旭，包 軍，王志美，代二慶，鄧全軍

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162；中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院2. 軍人醫(yī)療保健中心、3. 消化內(nèi)科，天津 300162)

食管癌是中國(guó)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，是全球第八大常見(jiàn)癌癥，也是癌癥死亡的第六大常見(jiàn)原因[1]，具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、治愈率差等特點(diǎn)[2]。早期手術(shù)切除是食管癌主要的治療手段，大部分患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期，經(jīng)常伴隨全身多處轉(zhuǎn)移，已錯(cuò)失最佳手術(shù)機(jī)會(huì)，因此，尋找有效防治食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物刻不容緩。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，許多傳統(tǒng)中藥的有效成分均有明顯的抗腫瘤活性。中藥蟾酥是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后及皮膚分泌物經(jīng)加工干燥而成，具有止痛、強(qiáng)心、抗菌、局部麻醉和抗腫瘤作用。華蟾酥毒基是來(lái)自蟾蜍皮膚的主要活性化合物，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，華蟾酥毒基具有抗乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和肝癌的抗腫瘤活性[3-4]，但是它在食管癌中的抗腫瘤機(jī)制少見(jiàn)報(bào)道。PI3K/Akt信號(hào)通路失衡是介導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移的重要分子機(jī)制[5]，通過(guò)激活A(yù)kt調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子，影響腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和血管生成，局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)在這一過(guò)程中起調(diào)控作用[6]。因此，本研究以人食管鱗癌細(xì)胞株Kyse-520為研究對(duì)象，觀察華蟾酥毒基對(duì)食管癌細(xì)胞體外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并探討其作用機(jī)制是否與FAK/PI3K/Akt通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 人食管鱗癌細(xì)胞株Kyse-520購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。華蟾酥毒基(批號(hào)3070，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥ 98%)購(gòu)自上海詩(shī)丹得生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Mixture(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)；Matrigel膠、Transwell小室(Corning公司)；總RNA提取試劑RNAiso Plus(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)伯樂(lè)公司)；BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶生物技術(shù)有限公司)；FAK、PTEN兔抗人多克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗(美國(guó)Proteintech公司)；p-FAK(Tyr397)、Akt、p-Akt(Ser473)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)、MMP-2兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)。

1.1.2儀器 JuLITMStage實(shí)時(shí)細(xì)胞記錄儀(韓國(guó)NanoEnTek公司)；超微量分光光度計(jì)NP80(德國(guó)IMPLEN公司)；PCR TCR0096(美國(guó)Thermo公司)；M2型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)；Power Pac Basic電泳儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 Kyse-520細(xì)胞按常規(guī)方法消化傳代，并置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，含0.1%溶媒(DMSO)的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液100 μL，設(shè)立對(duì)照組、藥物組和僅含培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔并孵育過(guò)夜。然后，空白組和對(duì)照組每孔補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基100 μL，藥物組每孔加入100 μL含有不同濃度華蟾酥毒基(0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中分別孵育12、24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(A)值。按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(A藥物組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。利用直線回歸方程計(jì)算華蟾酥毒基不同作用時(shí)間的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性 Kyse-520細(xì)胞分別設(shè)立對(duì)照組和華蟾酥毒基(25、50、100 μmol·L-1)組，將密度為1×105·L-1的細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，培養(yǎng)箱中孵育16～24 h使其形成單層細(xì)胞。含1% FBS的培養(yǎng)基饑餓12 h后，用10 μL槍頭在單層細(xì)胞中間劃3條平行直線。PBS洗凈劃傷細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入含不同藥物濃度的完全培養(yǎng)基，每孔選取5個(gè)固定位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)細(xì)胞記錄儀置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，設(shè)置6 h為1個(gè)循環(huán)，監(jiān)測(cè)9個(gè)循環(huán)后，利用JuLITMStage系統(tǒng)軟件進(jìn)行開(kāi)放傷口面積測(cè)量和百分比計(jì)算[7]。

1.2.3Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Kyse-520細(xì)胞，用含1% FBS的培養(yǎng)基饑餓12 h，然后加入含有不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基干預(yù)24 h。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將孔徑為8.0 μm的Transwell小室置于24孔板中。常規(guī)消化各組細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸浮液，并以5×104/孔的細(xì)胞密度接種在Transwell上室中，同時(shí)在下室中加入600 μL含15% FBS的完全培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用鑷子取出Transwell小室，PBS洗滌3次，100%甲醇室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，然后用濕棉簽擦去濾膜上表面的未遷移細(xì)胞。在顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)目的平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

在侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室上底面需要均勻涂覆60 μL用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基1 ∶4稀釋后的基質(zhì)膠，置于培養(yǎng)箱中凝固1 h。其余步驟與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)一致。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平 將Kyse-520細(xì)胞以5×105·L-1密度接種在6孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。然后分別加入2 mL含有不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基干預(yù)24 h。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用超微量分光光度計(jì)NP80測(cè)定RNA純度及濃度[8]。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成(Tab 1)。按實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：2 μL cDNA，10 μL 2×UltraSYBR Mixture，6.8 μL RNase ddH2O和0.6 μL兩種特異性引物(10 μmol·L-1)；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熔解曲線分析，以評(píng)估擴(kuò)增的特異性。每個(gè)cDNA樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量，與對(duì)照組相比的倍數(shù)變化作為mRNA相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

Tab 1 Primers used for RT-qPCR

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 融合度達(dá)80%的Kyse-520細(xì)胞用含不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基干預(yù)24 h。加入200 μL RIPA裂解液與1×酶抑制劑的混合液，冰上裂解30 min后，收集上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，40 μg總蛋白加入12% SDS-PAGE凝膠中電泳分離。采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉或5% BSA室溫封閉1 h，分別加入1 ∶1 000～1 ∶2 000稀釋的FAK、p-FAK，Akt、p-Akt、PTEN、VEGF-A、MMP-2、MMP-9和β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次后，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h。在成像系統(tǒng)上化學(xué)發(fā)光并對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細(xì)胞增殖活性Fig 1的CCK-8結(jié)果顯示，華蟾酥毒基以時(shí)間和濃度依賴的方式抑制食管癌細(xì)胞的增殖(P<0.05)，其作用Kyse-520細(xì)胞12、24、48 h的IC50值分別是6.002、0.625、0.079 μmol·L-1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一作用時(shí)間下，華蟾酥毒基濃度低于0.1 μmol·L-1時(shí)細(xì)胞增殖活性下降較少，因此，選取25、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以探討其對(duì)Kyse-520細(xì)胞侵襲遷移能力的影響[9]。

2.2華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細(xì)胞的遷移癌細(xì)胞的遷移能力與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[9]。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(Tab 2、Fig 2)，無(wú)論是6 h，還是48 h，各濃度華蟾酥毒基均能明顯縮小劃痕愈合面積(P<0.01)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，“傷口”逐漸增大，提示華蟾酥毒基抑制食管癌細(xì)胞的“二維”平面遷移，且該效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴性。不同濃度華蟾酥毒基干預(yù)24 h后，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 3)，隨著藥物濃度的增加，Kyse-520細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示華蟾酥毒基可明顯抑制食管癌細(xì)胞的“三維”平面遷移，且存在明顯的量效關(guān)系。

Fig 1 Effect of cinobufagin onproliferation of Kyse-520

*P<0.05vs12 h group at same concentration;#P<0.05vs24 h group at same concentration

2.3華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細(xì)胞的侵襲Matrigel基質(zhì)膠可以一定程度上模擬癌細(xì)胞在體內(nèi)侵襲環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)[10]，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)評(píng)估華蟾酥毒基對(duì)Kyse-520細(xì)胞侵襲能力的影響。Fig 3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)25、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基處理24 h后，Kyse-520的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05，P<0.01)，且呈濃度依賴的方式，提示華蟾酥毒基可明顯抑制食管癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.4華蟾酥毒基對(duì)食管癌Kyse-520細(xì)胞中FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響Tab 3的RT-qPCR結(jié)果顯示，當(dāng)華蟾酥毒基的濃度為50、100 nmol·L-1時(shí)，VEGF-A、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，PTEN mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01)，且呈一定的濃度依賴性，而FAK、Akt mRNA表達(dá)改變不明顯。

Tab 2 Effect of cinobufagin on migration of Kyse-520 cells detected by wound healing

**P<0.01vscontrol group at the same time

Fig 2 Effect of cinobufagin on migration of Kyse-520 cells(×40)

Fig3EffectofcinobufaginoninvasionandmigrationofKyse-520cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 3 Effect of cinobufagin on mRNA expression levels of FAK, Akt, PTEN, MMP-2, MMP-9 and VEGF-A in Kyse-520

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effect of cinobufagin on expression levels of relative proteins in Kyse-520 vs control group

2.5華蟾酥毒基對(duì)食管癌Kyse-520細(xì)胞中FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，當(dāng)華蟾酥毒基的濃度為50、100 nmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05，P<0.01)，PTEN蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)，F(xiàn)AK和Akt總蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。由于FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路主要是通過(guò)磷酸化發(fā)揮作用[6]，因此，Western blot檢測(cè)了p-FAK(Tyr397)、p-Akt(Ser473)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，二者磷酸化水平均明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)，提示華蟾酥毒基可明顯抑制FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路。

3 討論

食管癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，進(jìn)展迅速，并且經(jīng)常伴隨淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移。侵襲和轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞最具代表性的生物學(xué)特性，它的發(fā)生包括多個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及眾多信號(hào)通路，并且受到轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、微環(huán)境等影響[11]。靶向抑制誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)途徑作為治療腫瘤的一個(gè)新的策略已被廣大學(xué)者認(rèn)同，這也可能是很多天然藥物阻止或切斷食管癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程的作用機(jī)制。臨床資料顯示，華蟾酥注射液、片劑、膠囊等制劑針對(duì)惡性腫瘤的治療取得很好療效。大量實(shí)驗(yàn)室研究表明，其主要活性成分華蟾酥毒基的抗腫瘤機(jī)制可總結(jié)為抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化，促進(jìn)凋亡，引起周期阻滯，抑制腫瘤血管生成，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[12]。同時(shí)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，華蟾酥毒基可以抑制結(jié)腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[3,13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，華蟾酥毒基體外可明顯抑制人食管癌Kyse-520細(xì)胞的增殖，即使是對(duì)細(xì)胞增殖活性影響較弱的濃度也可明顯縮小劃痕愈合面積，減少遷移和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)，提示其對(duì)食管癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用。

大量研究已經(jīng)證實(shí)，抑制PI3K/Akt通路可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力[14]。PI3K是由110 ku催化亞基和85 ku調(diào)節(jié)亞基組成的異二聚體酶，活化的PI3K磷酸化PIP2以產(chǎn)生PIP3，隨后，PIP3積累并將Akt/PKB和PDK1募集到細(xì)胞膜上，被激活的Akt會(huì)使大量下游底物磷酸化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞遷移、周期進(jìn)程、存活和代謝[15]。FAK是一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，高水平的FAK誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移，并且與食管癌的不良預(yù)后相關(guān)。本研究采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)華蟾酥毒基處理的Kyse-520細(xì)胞中FAK和Akt的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，F(xiàn)AK和Akt總蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，進(jìn)一步檢測(cè)其磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基可明顯下調(diào)p-FAK(Tyr397)和p-Akt(Ser473)。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶可以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，MMP-2和MMP-9是其中最重要的一類(lèi)。VEGF家族直接或間接地與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，而VEGF-A可以激活靜息血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)血管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。有研究證實(shí)，F(xiàn)AK通過(guò)激活PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)VEGF-A、MMP-2和MMP-9的活性，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，華蟾酥毒基濃度依賴性地降低VEGF-A、MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。上述結(jié)果提示，華蟾酥毒基通過(guò)FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制食管癌的遷移和侵襲。

PTEN是一種雙重脂質(zhì)蛋白磷酸酶，是FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子。正常情況下，PTEN與PI3K的功能相反，可以通過(guò)去磷酸化將PIP3轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2；同時(shí)，PTEN還具有特異性蛋白磷酸酶功能，通過(guò)下調(diào)FAK酪氨酸磷酸化，抑制整合素介導(dǎo)的細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞遷移擴(kuò)散和黏附[10]。在鼠胚胎干細(xì)胞或人癌細(xì)胞系中，PTEN功能的喪失導(dǎo)致PIP3的積累，模擬PI3K激活的作用，并激活其下游效應(yīng)物PDK1、Akt和Rac1/CDC42[15]。本研究也顯示，華蟾酥毒基在削弱FAK磷酸化和抑制PI3K/Akt活化的同時(shí)，明顯增加Kyse-520細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。

綜上所述，華蟾酥毒基通過(guò)誘導(dǎo)PTEN表達(dá)，負(fù)調(diào)控FAK/PI3K/Akt途徑，下調(diào)VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所完成，感謝課題組老師同學(xué)們的協(xié)助。)