化療所致造血干細(xì)胞衰老的相關(guān)信號(hào)通路及中藥治療進(jìn)展

王玨，陳朝輝

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310053；2.象山縣第一人民醫(yī)院，浙江 象山 315700)

隨著發(fā)病率和死亡率的不斷提高，癌癥已成為我國主要的死亡原因，也是重大的公共衛(wèi)生問題。發(fā)布的文獻(xiàn)顯示[1]，2015年我國新發(fā)腫瘤病例429.2萬，致死病例281.4萬。雖然癌前檢查的技術(shù)不斷得到提升，但是大多數(shù)腫瘤患者在疾病被診斷時(shí)已處于中晚期，化療是腫瘤治療手段中必不可少的，化療的療效確切，但在殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)，往往也對(duì)正常的細(xì)胞造成損害，尤其是對(duì)骨髓造血功能的抑制，有研究表明[2]90%以上的化療藥物都會(huì)引起骨髓抑制。目前認(rèn)為化療導(dǎo)致骨髓抑制最關(guān)鍵的機(jī)制[3]是造血干細(xì)胞衰老。

造血干細(xì)胞衰老的機(jī)制目前仍不明確?，F(xiàn)有研究[4]表明其機(jī)制包括DNA損傷、端?？s短、活性氧(ROS)水平升高、表觀遺傳修飾、細(xì)胞極性改變、代謝及造血微環(huán)境等幾方面，涉及到多條信號(hào)通路。多數(shù)研究[5-6]認(rèn)為不同的DNA損傷因素最終均會(huì)通過p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路抑制正常細(xì)胞周期的進(jìn)行，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老。p53-p21通路也能間接的被端?？s短所激活，進(jìn)而引起造血干細(xì)胞衰老[7]。ROS水平升高可以直接或者間接的激活p38-MApK、p53-p21、p16-Rb通路導(dǎo)致造血系統(tǒng)應(yīng)激能力下降而造成造血干細(xì)胞衰老[8]。

化療后骨髓抑制屬于中醫(yī)“虛勞”范疇，其病機(jī)主要表現(xiàn)為脾腎兩虛。多種中藥復(fù)方及中藥單體被證明，在防治骨髓抑制，抑制造血干細(xì)胞衰老上有著良好的作用及優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)將造血干細(xì)胞衰老的相關(guān)信號(hào)通路，及中醫(yī)藥干預(yù)的研究做一綜述。

1 造血干細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路

1.1 p53-p21Waf1/Cip1通路

研究顯示，化療造成DNA損傷后，會(huì)招募和激活A(yù)TR和ATM兩種蛋白激酶聚集于DNA損傷部位，ATR和ATM分別感應(yīng)不同形式的 DNA 損傷，可以使損傷部位的H2A組蛋白變異體(H2AX)磷酸化進(jìn)而觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)[9]以及周期檢測(cè)點(diǎn)激酶CHK2和CHK1的磷酸化，再通過下游級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)將DDR信號(hào)擴(kuò)散，從而誘導(dǎo)p53的激活[10]，p53能夠直接誘導(dǎo)周期蛋白依賴型激酶抑制劑p21的表達(dá)，從而下調(diào)CDK2，最終將細(xì)胞周期阻斷在G1期，從而抑制細(xì)胞自我更新能力，造成造血干細(xì)胞衰老[11]。

1.2 p16 Ink4a-Rb通路

研究表明，當(dāng)體內(nèi)ROS水平升高到一定水平后能夠激活p38/MApK通路[12]，進(jìn)而激活另一周期蛋白依賴型激酶抑制劑p16Ink4a的表達(dá)，p16Ink4a作為CDK的主要抑制劑，可以抑制CDK4/6激活從而降低Rb的磷酸化而減少E2F基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1期并且形成細(xì)胞衰老相關(guān)的異染色質(zhì)位點(diǎn)[13]，使衰老進(jìn)入不可逆階段。

1.3 SIRT6 /NF-κB信號(hào)通路

SIRT6是調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的關(guān)鍵基因，乙?；窼IRT6的功能缺陷可影響DNA的修復(fù)，而導(dǎo)致衰老。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，SIRT6能夠促進(jìn)NF-κB靶基因啟動(dòng)子H3K9的脫乙酰作用，從而抑制NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的端粒非依賴性干細(xì)胞衰老。

1.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

研究表明[15]Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)造血微環(huán)境而引起造血干細(xì)胞衰老。當(dāng)胞外不存在Wnt信號(hào)通路抑制物時(shí)，Wnt與細(xì)胞膜上Frizzled和LRp/56受體結(jié)合，抑制了GSK-3β活性，從而減弱其對(duì)β-catenin的磷酸化作用，引起β-catenin的聚集，進(jìn)而向細(xì)胞核內(nèi)移位，與FOXO轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制β-catenin下游TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄，引起造血干細(xì)胞衰老。

1.5 PI3K/AKT /mTOR信號(hào)通路

當(dāng)外界信號(hào)激活磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3 kinases,PI3K)時(shí)，PI3K會(huì)將質(zhì)膜上3、4-二磷酸磷脂酰肌醇(PI-4,5-P2, PIp2)磷酸化為3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4,5-P3,PIp3)[16]，活化的PIp3會(huì)募集胞質(zhì)內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)，通過與AKT N端的pH結(jié)構(gòu)域結(jié)合協(xié)同激酶PDK1磷酸化AKT的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser473)和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr308)[17]，激活A(yù)KT，活化的AKT可以直接磷酸化mTOR使其激活，從而促進(jìn)HSC的生長和存活等過程。

PI3K及其效應(yīng)物AKT是維持HSC穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，部分PI3K的缺失會(huì)導(dǎo)致HSC再填充潛力的降低[18]。AKT和mTOR的過度激活會(huì)使HSC擴(kuò)增，大量進(jìn)入細(xì)胞周期，發(fā)生HSC的耗竭，這對(duì)于骨髓抑制的病人來說是一個(gè)惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)同時(shí)敲除AKT1和AKT2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致HSC滯留在G0期，無法向下分化。

1.6 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路可以不通過第二信使，直接對(duì)下游HES、HEY，以及E47等核轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞的增殖分化具有重要影響作用。哺乳動(dòng)物中存在Notch1-4四種Notch受體蛋白，以及Jagged-1,Jagged-2,Delta-like-1,3,4五種Notch配體蛋白，均為跨膜蛋白。Notch受體蛋白經(jīng)三次酶切后跨膜進(jìn)入細(xì)胞核，繼而通過DNA結(jié)合蛋白CSL依賴或非依賴途徑，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子HES和HEY、或抑制轉(zhuǎn)錄因子E47的功能，促進(jìn)下游基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和黏附等的影響[19]。

1.7 TGF-β信號(hào)通路

TGF-β被認(rèn)為是HSC體外生長的最有效抑制劑之一。在穩(wěn)態(tài)環(huán)境中，HSC處于休眠狀態(tài)，而休眠狀態(tài)對(duì)于維持HSC功能及數(shù)量起著非常重要的作用，TGF-β被發(fā)現(xiàn)是HSC休眠的主要調(diào)節(jié)因子。TGF-β信號(hào)通路的激活與Smad蛋白有著密切的關(guān)系。受體激活型R-Smads可直接被TGF-β磷酸化激活，然后與通用型Co-Smads結(jié)合，形成異源二聚體，進(jìn)一步導(dǎo)致活性聚合體的核內(nèi)累積，發(fā)揮針對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；而另有一種Smad蛋白—抑制型I-Smads，其發(fā)揮的作用剛好和受體激活型相反，I-Smads通過抑制TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)，阻斷R-Smads和Co-Smads的相互作用來負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β。Smad蛋白的磷酸化可以進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑如p15Ink4b、 p21Cip1和p27Kip1，從而干預(yù)造血干細(xì)胞的生長抑制[20]。

2 中藥干預(yù)造血干細(xì)胞衰老

2.1 當(dāng)歸多糖對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響

中藥當(dāng)歸有補(bǔ)血活血作用，被譽(yù)為“補(bǔ)血之圣藥”“活血行氣之要藥”?！侗静菡氛J(rèn)為當(dāng)歸“誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也。”“凡有形虛損之病，無所不宜”。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸的主要成分，能夠促進(jìn)造血。張先平等[21-22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖能顯著改善衰老造血干細(xì)胞G1期阻滯及SA-β-gal(β-半乳糖苷酶)陽性率的增加；增加端粒長度和端粒酶活性；下調(diào)p53、p21、p16的表達(dá)，上調(diào)CDK4/6、CyclinD及CyclinE的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞衰老。但研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖對(duì)CDK2的表達(dá)未見明顯影響，因此當(dāng)歸多糖緩解造血干細(xì)胞衰老的機(jī)制可能與抑制p16-Rb信號(hào)通路過度激活有關(guān)。張巖巖等[23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖能顯著降低衰老造血干細(xì)胞的SA-β-gal 染色陽性率和ROS水平；通過下調(diào)β-catenin、phospho-GSK-3β和TCF-4蛋白表達(dá)，上調(diào)GSK-3β 蛋白表達(dá)，而這些蛋白都是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路上的機(jī)制分子，故其研究認(rèn)為當(dāng)歸多糖延緩造血干細(xì)胞的機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路過度激活有關(guān)。

2.2 黨參多糖對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響

黨參味甘，性平。有補(bǔ)中益氣、止渴、健脾益肺，養(yǎng)血生津的作用。黨參多糖是從黨參中提取的有效成分，近年來的研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖在調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗氧化等很多方面具有較好的生物活性。王慧云[24]發(fā)現(xiàn)黨參多糖可以清除衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的自由基，降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黨參多糖可以影響衰老的EA.hy926細(xì)胞的甲基化程度及表觀遺傳相關(guān)蛋白及基因表達(dá)，使EZH2、Bmi-1、DNMT1 mRNA的表達(dá)含量升高，JMJD3 mRNA的表達(dá)量下降，減弱氧化作用下所導(dǎo)致的應(yīng)激衰老進(jìn)程，從而緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。許朋等[25]發(fā)現(xiàn)黨參多糖可以明顯提升血清中C3、C4、IgG、IgM、IgA、GH、IGF-1、T3、T4、INS的生成水平，對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下大鼠具有明顯的增強(qiáng)作用。進(jìn)一步的研究顯示，黨參多糖不僅可以降低體內(nèi)的ROS水平，改善氧化損傷，改善免疫功能低下，還能干預(yù)衰老相關(guān)的信號(hào)通路。李義波等[26]發(fā)現(xiàn)黨參多糖干預(yù)后，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率明顯降低，造血干細(xì)胞G1期阻滯明顯降低，并且p53、p21、Bax蛋白表達(dá)下調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。因此，實(shí)驗(yàn)證明黨參多糖能夠干預(yù)p53-p21信號(hào)通路從而延緩造血干細(xì)胞的衰老，同時(shí)也可以調(diào)控Bcl-2蛋白干預(yù)造血干細(xì)胞的凋亡。

2.3 人參皂苷對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響

人參自古譽(yù)為“百草之王”，味甘、微苦，性溫、平。歸脾、肺經(jīng)、心經(jīng)。補(bǔ)氣，固脫，生津，安神，益智。人參皂苷被認(rèn)為是人參中的主要活動(dòng)成分，包括RH2、Rg1、Rg2、Rg3等，其主要作用表現(xiàn)為抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化及抗衰老能力、提升機(jī)體免疫能力等方面，臨床上的研究多以人參皂苷Rg1為主要研究對(duì)象。周玥、李淵等[27-30]的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，相較于衰老模型組，人參皂苷Rg1干預(yù)后，Sca-1+HSC/HPC G0/G1期細(xì)胞比例、SA-β-Gal染色陽性率明顯下降，CFU-Mix數(shù)量明顯升高；SIRT6 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，證實(shí)了人參皂苷Rg1可能通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號(hào)軸抵抗造血干細(xì)胞的衰老。夏婕妤[31]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1干預(yù)后，Sca-1+HSC/HPCs增殖能力增強(qiáng)；形成CFU-Mix數(shù)量增加；SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞百分率減少；細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào),GSK-3β蛋白表達(dá)量上降，TCF-4蛋白及β-catenin、C-myc、CyclinD1 mRNA表達(dá)下調(diào)；Sca-1+HSC/HPCs內(nèi)ROS水平，γ-H2AX水平；血清中8-OH-dG含量下降；p53及p21蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)，說明人參皂苷Rg1可能通過p53/p21通路、細(xì)胞DNA氧化損傷、氧化應(yīng)激等機(jī)制調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而延緩Sca-1+HSC/HPCs衰老。Zeng YC等[32]的研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1不僅能夠改善衰老大鼠體內(nèi)的氧化損傷，還能明顯降低p16、p21、p53的表達(dá)水平，進(jìn)一步降低其下游細(xì)胞周期蛋白CDK2和CDK4的表達(dá)，從p53-p21和p16-Rb通路緩解造血干細(xì)胞的衰老。

2.4 中藥復(fù)方對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響

脾胃為氣血生化之源，脾胃受損，脾失健運(yùn)，則氣血生化乏源; “腎藏精，精者，血之所成也。”腎精虧損，則血之源頭窮竭[33]。故臨床上治療化療后的造血干細(xì)胞衰老，多采用健脾補(bǔ)腎的方劑。張陽陽[34]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎化瘀生新方可通過下調(diào)衰老關(guān)鍵基因p16INK4a、p53、p21的表達(dá)來延緩BMSCs的衰老，說明補(bǔ)腎化瘀生新方調(diào)控BMSCs的衰老與其抑制p16-pRb和p53-p21途徑密切相關(guān)。相對(duì)于中藥單體來說，中藥復(fù)方成分更加復(fù)雜，其發(fā)揮作用的成分也更加多樣，并且不同的配伍會(huì)導(dǎo)致中藥效果存在差異?？琢樟值萚35]發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖可以誘導(dǎo)形成亞急性衰老大鼠，其體內(nèi)的總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)水平及抑制超氧陰離子自由基能力下降，過氧化氫(H2O2)含量升高，p16蛋白表達(dá)水平上調(diào)，左歸丸對(duì)上述癥狀有逆轉(zhuǎn)作用，說明p16通路可能是左歸丸調(diào)控細(xì)胞衰老的機(jī)制之一。然而與左歸丸相比，六味地黃丸未能明顯降低大鼠體內(nèi)H2O2含量，推測(cè)可能是因?yàn)樽髿w丸中配伍的補(bǔ)陽藥鹿角膠具有更加強(qiáng)力的抗氧化能力。

2.5 針灸對(duì)造血干細(xì)胞衰老的影響

針灸是中醫(yī)針法和灸法的總稱，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下把針具(通常指毫針)按照一定的角度刺入患者體內(nèi)，運(yùn)用捻轉(zhuǎn)與提插等針刺手法來對(duì)人體特定部位進(jìn)行刺激從而達(dá)到治療疾病的目的。針灸是中國特有的一種“內(nèi)病外治”的治療手段，針灸在臨床上具有操作簡便，療效顯著，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)化療后造成的骨髓抑制，研究發(fā)現(xiàn)[36]針灸環(huán)磷酰胺作用后的骨髓抑制小鼠，可以抑制Notch信號(hào)通路的過度激活，上調(diào)Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因numb1、numb2的表達(dá)，增強(qiáng)骨髓造血功能。因此，抑制Notch信號(hào)通路可能是針灸減輕CTX化療引起的骨髓抑制、改善造血功能的分子機(jī)制之一。雖然有報(bào)道[37]稱針灸可以改善阿爾茨海默病小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞治療后的腦微環(huán)境，然而，至今未見更多關(guān)于針灸干預(yù)造血干細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路的研究。

3 小結(jié)

目前，針對(duì)化療后造血干細(xì)胞衰老的信號(hào)通路研究，最集中最經(jīng)典的還是p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路。中醫(yī)藥在延緩造血干細(xì)胞的作用中存在著多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，如人參皂苷Rg1和當(dāng)歸多糖都能通過p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路來調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的衰老，中藥通過另外的通路緩解細(xì)胞衰老的研究也有建樹。本課題組也在進(jìn)行基于p16Ink4a-Rb信號(hào)通路探討龜鹿二仙膠抗化療誘導(dǎo)的骨髓造血干細(xì)胞衰老的分子機(jī)制研究[38]。但目前對(duì)于中醫(yī)藥延緩造血干細(xì)胞衰老的調(diào)控基因的認(rèn)識(shí)仍不足，希望能進(jìn)一步深入研究。