“第六堿基”
——5-羥甲基胞嘧啶研究進(jìn)展

夏 婭 ，樊丹平 ，戴自城 ，肖 誠 *

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨床研究所，北京 100029；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；4.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物及化學(xué)工程系，中國香港）

表觀遺傳學(xué)是目前生物領(lǐng)域最熱門的研究之一，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的一種重要方式[1]，指在DNA分子中加入甲基的過程。大量研究表明，DNA甲基化可引起DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性以及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)[2]。遺傳信息載體DNA由腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶4種堿基組成，胞嘧啶 （cytosine，C）可在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下發(fā)生甲基化，生成 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）。 5mC是一種表觀遺傳修飾機(jī)制，意指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳的變化，被稱為“第五堿基”。

5-羥甲基胞嘧啶 （5-hydroxymethylcytosine，5hmC）是由甲基胞嘧啶雙加氧酶 （ten-eleven translocation proteins，TETs）介導(dǎo)的，5mC的羥甲基化形式，是DNA去甲基化的中間產(chǎn)物，被稱為“第六堿基”，同樣發(fā)揮著表觀遺傳修飾的重要作用[3]。5hmC在不同組織中表達(dá)各異，其在脊髓和中樞神經(jīng)中含量最高，在腎臟、心臟、肺部、骨骼肌、膀胱和鼻上皮細(xì)胞的含量居中，而脾臟、肝臟和內(nèi)分泌腺中的含量最低。隨著對(duì)TETs功能的認(rèn)識(shí)逐漸加深，5hmC的表觀遺傳作用日益受到科學(xué)界重視。

1 5hmC的生成與去甲基化

1953年，Wyatt GR和Cohen SS在T2噬菌體DNA中發(fā)現(xiàn)5hmC[4]。半個(gè)多世紀(jì)后，Kriaucionis S和Heintz N在小鼠神經(jīng)元和腦組織DNA內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了5hmC[5]。5hmC在哺乳動(dòng)物內(nèi)的相關(guān)科學(xué)研究隨之展開。

5hmC曾被認(rèn)為是DNA受損的產(chǎn)物[6]，但之后的研究推翻了這種觀點(diǎn)。爾后去甲基化酶TETs的發(fā)現(xiàn)，為理解5hmC的生成提供了新的視點(diǎn)。TETs屬于α-酮戊二酸加氧酶家族，依賴Fe2+作為輔助因子，將底物的雙電子氧化作用與α-KG的氧化脫羧作用相結(jié)合[7]。TETs包含TET1、TET2、TET3 3種具有組織表達(dá)特異性的亞型，能在不同的組織或細(xì)胞中將5mC逐漸氧化轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC。其中TET1存在于單細(xì)胞胚胎到囊胚期，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，且N端含有一個(gè)保守CXXC鋅指結(jié)構(gòu)域可與染色體相互作用[8]。有研究報(bào)道，小鼠原始生殖細(xì)胞中的DNA在TET1和TET2高水平的驅(qū)動(dòng)下，通過將5mC轉(zhuǎn)化成5hmC來實(shí)現(xiàn)全面去甲基化[9]。TET3在小鼠雄性原核階段特異性表達(dá)，其介導(dǎo)的DNA羥甲基化作用參與自然受精后合子父本DNA的表觀遺傳重編[10]。正常情況下，基因組中大部分的5hmC來源于之前存在的5mC，并在TETs的作用下保持DNA甲基化狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡。

DNA甲基化通過招募基因表達(dá)蛋白，或抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)，使細(xì)胞分化為穩(wěn)定而獨(dú)特的甲基化模式[11]。在某些情況下，DNA甲基化水平可以通過涉及活性DNA去甲基化的機(jī)制迅速改變。5hmC生成是去甲基化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它既可以通過DNA復(fù)制被被動(dòng)消耗，也可以通過迭代氧化和胸腺嘧啶DNA糖基化酶介導(dǎo)的基底切除修復(fù)被主動(dòng)還原為胞嘧啶[12]，還可以作為活躍的氧化去甲基化的中間產(chǎn)物。目前關(guān)于5hmC在DNA去甲基化過程中的作用機(jī)制主要有兩種可能方式：第一種是5hmC在TETs介導(dǎo)下參與了主動(dòng)去甲基化過程；第二種是細(xì)胞生長(zhǎng)過程中5hmC的存在影響了DNMT1介導(dǎo)的DNA甲基化過程，被動(dòng)參與DNA的去甲基化[13]。

2 不同技術(shù)檢測(cè)5hmC在哺乳動(dòng)物體內(nèi)不同組織的分布及基因分布特點(diǎn)

2.1 組織分布特點(diǎn)

Szwagierczak[14]采用放射標(biāo)記法對(duì)小鼠不同成體組織和分化胚胎干細(xì)胞中的5hmC水平進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果表明：基因組5hmC的最高水平出現(xiàn)在大腦區(qū)域，其中皮質(zhì)、海馬、小腦區(qū)約占0.9%～1.3%；腎臟內(nèi)水平也較高，達(dá)到了0.8%；肺組織和肝組織為0.3%～0.4%。此外，Globisch等[15]采用HPLC-MS分析和免疫組化方法，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠所有組織和細(xì)胞中均存在5hmC，且濃度最高的是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞中，為0.3%～0.7%；脊髓DNA中的5hmC為0.47%；腎臟、鼻腔上皮、膀胱、心臟、骨骼肌和肺部的DNA中5hmC為0.15%～0.17%；肝臟、脾臟和內(nèi)分泌腺 （睪丸和垂體）的DNA中5hmC含量最低，為0.03%～0.06%。在人體內(nèi)Li等[16]通過免疫測(cè)定發(fā)現(xiàn)不同組織中5hmC的含量存在顯著差異：其中大腦 （0.67%）、腎組織（0.38%）、結(jié)腸組織（0.45%）、直腸組織（0.57%）和肝組織（0.46%）中5hmC含量豐富；肺中含量較低，約0.14%；心臟、乳腺、胎盤中5hmC含量極低，均在0.05%左右；且癌組織內(nèi)含量較正常組織顯著降低。雖然不同時(shí)期各組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出來的數(shù)據(jù)都有一定的差異，但是不同組織內(nèi)5hmC豐度大致可分為 3 類：（1）高豐度組：腦組織、脊髓；（2）中豐度組：腎、直腸、結(jié)腸、骨骼?。唬?）低豐度組：心臟、脾、內(nèi)分泌腺、胎盤。而肝和肺的5hmC含量在不同檢測(cè)中差異較大，需進(jìn)一步精確測(cè)定。

2.2 基因分布特點(diǎn)

越來越多的證據(jù)表明，5hmC在胚胎干細(xì)胞等細(xì)胞類型中大量存在，通過5hmC基因組圖譜檢測(cè)將有利于進(jìn)一步了解5hmC的功能。Stroud等[17]通過hmeDIP-seq生成了人類胚胎干細(xì)胞中5hmC的全基因組圖譜，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)有3028個(gè)增強(qiáng)子與5hmC峰重疊，多效性因子NANOG和OCT4結(jié)合位點(diǎn)以及絕緣體結(jié)合蛋白CTCF位點(diǎn)均富集了5hmC，這說明5hmC在增強(qiáng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上高度富集。Jin等[18]通過應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)人腦額葉組織DNA中5hmC的發(fā)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5hmC富集在啟動(dòng)子和基因體區(qū)域，尤其是非編碼區(qū)。對(duì)于CpG含量中等或較高的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5hmC峰值與基因表達(dá)水平無關(guān)。與5mC相比，5hmC對(duì)基因的靶向性更強(qiáng)，且5hmC在基因體中的存在與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。因此，我們有理由認(rèn)為，5hmC可能與多種調(diào)控因子和調(diào)控過程有關(guān)。

3 5hmC的生理功能

噬菌體DNA的5hmC修飾可以避免其在感染大腸桿菌宿主的過程中受到限制和降解[19]。哺乳動(dòng)物大腦中5hmC表達(dá)豐富，說明它在調(diào)控腦組織的發(fā)育方面發(fā)揮著特殊作用。對(duì)胚胎小鼠大腦神經(jīng)元研究后發(fā)現(xiàn)，5hmC在神經(jīng)元分化過程中增加，且常伴隨著H3K27me3的損失，而這一狀態(tài)會(huì)促進(jìn)大腦發(fā)育[20]。與該結(jié)果一致，缺乏TET1的小鼠表現(xiàn)出海馬神經(jīng)受損，并伴有學(xué)習(xí)和記憶障礙[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TETs蛋白是早期胚胎分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的刺激會(huì)引起TET1、TET2表達(dá)丟失，以及基因組5hmC的丟失。相反，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與TET 1、TET 2和5 hmC的增加有關(guān)[22]。

雖然5hmC在哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的作用和作用機(jī)制尚未完全清楚，但其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，神經(jīng)元的促進(jìn)是肯定的。一旦這種生理狀態(tài)被破壞，就會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。

4 5hmC相關(guān)疾病的研究

4.1 5hmC與腫瘤

甲基化狀態(tài)的改變被認(rèn)為與失活抑癌基因和激活原癌基因有關(guān)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。5hmC作為DNA去甲基化的中間體，在機(jī)體中的含量和分布甚至已經(jīng)開始被作為多種腫瘤疾病早期診斷和預(yù)后的新標(biāo)志之一[23]。研究發(fā)現(xiàn)降低TET1的水平和活性，從而導(dǎo)致5hmC水平降低，與造血系統(tǒng)惡性腫瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌相關(guān)，并且乳腺癌的侵襲率增加是TET1下調(diào)的直接后果。在各種骨髓惡性腫瘤也發(fā)現(xiàn)了TET2突變及5hmC水平降低[24]。在肺癌中，隨著肺癌發(fā)病進(jìn)程的推進(jìn)，5hmC呈階段性逐漸減少；肝癌和胰腺癌組織細(xì)胞內(nèi)羥甲基化狀態(tài)也會(huì)發(fā)生特異性改變[25]；結(jié)直腸和胃腫瘤樣本中5hmC豐度較正常組織平均降低85%和64%[26]；在T細(xì)胞淋巴瘤（T-cell lymphoma，TCL）中，可檢測(cè)到 5hmC 水平降低，且這種改變與參與調(diào)控胞嘧啶甲基化的基因突變無關(guān)[27]；黑色素瘤患者5hmC的表達(dá)也有相似的結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)晚期黑色素瘤患者5hmC表達(dá)較早期少，且已發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者的5hmC較未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)少[28]；其他如鱗狀細(xì)胞癌、甲狀旁腺腺瘤等腫瘤中均可檢測(cè)到5hmC表達(dá)降低。這些研究結(jié)果也進(jìn)一步說明5hmC與腫瘤疾病密切相關(guān)。

4.2 5hmC與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

之前的研究曾指出，腫瘤的發(fā)生會(huì)大量消耗5hmC，然而膠質(zhì)瘤是一個(gè)例外。膠質(zhì)瘤是一種惡性腦部腫瘤，與其他腫瘤相比，膠質(zhì)瘤中5hmC水平相對(duì)較高。因?yàn)槟z質(zhì)母細(xì)胞發(fā)育需要TET1介導(dǎo)的5hmC的產(chǎn)生，而5hmC招募與亞甲基化相關(guān)的PRMT1（CHTOP）染色質(zhì)靶蛋白，該蛋白使組蛋白H4上的精氨酸甲基化，從而激活癌癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[29]。另外有研究通過氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)正常和癡呆患者的腦組織DNA，并對(duì)5hmC進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者腦組織DNA中5hmC水平發(fā)生了顯著變化，且不同分期表現(xiàn)不同[30]。有研究還發(fā)現(xiàn)5hmC介導(dǎo)的DNA去甲基化途徑可能參與雷特綜合征的發(fā)病機(jī)制[31]。說明5hmC可能與年齡相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。

4.3 5hmC與自身免疫性疾病

對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE）患者CD4+T細(xì)胞進(jìn)行基因組羥甲基化分析發(fā)現(xiàn)[32]：SLE患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA中5hmC水平升高，且在細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到2748個(gè)5hmC表達(dá)上調(diào)的基因。而這些基因多在神經(jīng)營養(yǎng)素信號(hào)、WNT信號(hào)、MAPK信號(hào)、鈣信號(hào)和mTOR信號(hào)通路等關(guān)鍵通路中富集。同時(shí)，還可發(fā)現(xiàn)TET2、TET3表達(dá)上調(diào)。

5hmC 和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）也表現(xiàn)出潛在的關(guān)系。最近一項(xiàng)研究表明，TET2可通過維持基因組5hmC水平調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化。TET2敲除的小鼠體內(nèi)有破骨細(xì)胞功能受損的表現(xiàn)，如骨硬化，骨量增加；且在不同基因組位點(diǎn)5hmC表達(dá)水平不同[33]。RANKL/OPG是破骨細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控因子，有研究表明，CpG島甲基化的改變會(huì)導(dǎo)致RANKL/OPG基因發(fā)生差異性表達(dá)[34]。而破骨細(xì)胞的分化水平與RA密切相關(guān)，可以猜測(cè)，5hmC可能參與RA的病理變化過程。

5 結(jié)語

DNA甲基化對(duì)于人類細(xì)胞分化、發(fā)育過程的重要性得到了普遍認(rèn)同，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病的發(fā)病機(jī)制中也開展了較為深刻的研究。很長(zhǎng)一段時(shí)間以來，5mC被視為DNA共價(jià)修飾的唯一方式，但是5hmC及TETs的發(fā)現(xiàn)推翻了這種觀點(diǎn)。作為后起之秀的5hmC，其相關(guān)研究也在逐漸深入，科學(xué)技術(shù)的發(fā)展將5hmC表觀遺傳作用提升到一個(gè)更加精確的維度，且現(xiàn)有研究已顯示5hmC在多種疾病組織內(nèi)的表達(dá)發(fā)生了特異性改變。目前文獻(xiàn)中關(guān)于5hmC與RA、銀屑病、糖尿病的報(bào)道尚無，但這些疾病均與DNA甲基化具有相關(guān)性，因此5hmC在疾病中的變化還需要進(jìn)一步深入研究，同時(shí)也希望5hmC的研究能為疾病的診療帶來新的突破。