中草藥調(diào)控腸道微生態(tài)組成與代謝的研究進(jìn)展

王鑫楠，王維維，辛貴忠，劉麗芳

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

腸道菌群作為寄存于人體胃腸道的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)，容納了數(shù)萬(wàn)億個(gè)微生物細(xì)胞，種類超過500種，其中絕大多數(shù)為絕對(duì)厭氧菌，數(shù)量是兼性厭氧菌和需氧菌的100～1 000倍[1-2]。十億多年來，哺乳動(dòng)物和微生物的共同進(jìn)化導(dǎo)致了他們之間的相互依賴性。因此，人體保持健康或發(fā)生疾病皆與腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的失調(diào)密切相關(guān)。通過群體感應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)與代謝產(chǎn)物的相互制約等多種因素，正常菌群之間以及正常菌群與宿主之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，菌群結(jié)構(gòu)保持相對(duì)穩(wěn)定。但當(dāng)正常菌群受到來自于機(jī)體內(nèi)外的理化、生物因素的刺激時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失衡，進(jìn)而引發(fā)疾病[3-5]。長(zhǎng)期以來，科學(xué)家使用多種手段來對(duì)腸道菌群進(jìn)行研究，取得了引人矚目的研究成果。

中草藥作為中華民族的瑰寶，具有獨(dú)特的治療作用和防治療效。但由于中藥及其復(fù)方的組成十分復(fù)雜，且具有多成分、多層次、多靶點(diǎn)起效的特點(diǎn)，人們對(duì)于中藥調(diào)節(jié)腸道菌群的具體作用機(jī)制仍然知之甚少。本文將近年來與中藥改善腸道菌群平衡作用相關(guān)的研究成果和涉及的主要分析技術(shù)進(jìn)行了歸納和總結(jié)，以期為進(jìn)一步深入探討中藥發(fā)揮作用的科學(xué)內(nèi)涵提供一定的參考。

1 中草藥改善腸道微生態(tài)平衡

中藥的給藥方式常見于口服給藥，除一些小分子單體物質(zhì)能夠被吸收入血以外，很多大分子物質(zhì)往往會(huì)進(jìn)入消化道，與腸道微生物群相互作用[6]。腸道微生態(tài)包括腸道菌群菌種、腸道菌群代謝物和黏膜屏障。中藥活性成分調(diào)控腸道微生態(tài)平衡，主要體現(xiàn)在中藥化學(xué)成分對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和代謝產(chǎn)物的影響。

1.1 中藥緩解腸道菌群失調(diào)

健康的成年人腸道微生物群以擬桿菌門和厚壁菌門為主，但也包括較小比例的放線菌門，變形菌門和疣微球菌門，以及產(chǎn)甲烷的古菌(主要是甲烷短桿菌屬)，真核生物(主要是酵母)和多種噬菌體[7]。正常情況下，腸道菌群與宿主之間維持著良好的生態(tài)平衡。在一定條件下，這種平衡的關(guān)系被打破，在不同分類水平上會(huì)發(fā)生菌種比例失衡。腸道微生物群在代謝疾病方面起著關(guān)鍵作用，包括2型糖尿病和肥胖等。Jia Xu等人[8]研究了葛根芩連湯對(duì)2型糖尿病的治療作用。通過實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯能夠提升腸道菌群中柔嫩梭菌群的豐富度。此菌種與空腹血糖和餐后2 h血糖呈負(fù)相關(guān)水平，而與胰島B細(xì)胞功能的穩(wěn)態(tài)呈現(xiàn)正相關(guān)。2005年研究者首次提出肥胖可能和腸道菌群結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠腸道內(nèi)擬桿菌門細(xì)菌和厚壁菌門細(xì)菌的變化[9]。另一項(xiàng)研究表明，靈芝多糖可改變肥胖小鼠中腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增大擬桿菌門與厚壁菌門細(xì)菌的比例，從而達(dá)到預(yù)防肥胖及其并發(fā)癥的目的[10]。Weidong Xie等人研究發(fā)現(xiàn)，黃連生物堿和小檗堿顯著降低了厚壁菌門和擬桿菌門在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠糞便總細(xì)菌中的比例?？偵飰A和小檗堿對(duì)腸道微生物的作用導(dǎo)致膳食多糖的降解減少，降低了熱量攝入，改善肥胖小鼠的機(jī)體代謝。這些數(shù)據(jù)表明，中草藥配方能誘導(dǎo)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)比例變化[11]。

腸道菌群按照對(duì)宿主健康的影響，可分為益生菌、有害菌和機(jī)會(huì)致病菌[12]。機(jī)會(huì)致病菌在正常菌群中原本不致病，但一旦處于生態(tài)失調(diào)的狀態(tài)下，這類細(xì)菌可成為致病菌，比如大腸桿菌、β變形桿菌、梭菌屬和脫硫弧菌屬等[13]。近年來，大量研究表明中藥可以通過促進(jìn)益生菌增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)，使腸道保持相對(duì)穩(wěn)態(tài)。在一項(xiàng)關(guān)于祛濕化瘀方治療非酒精性脂肪肝的研究中，Xiaochen Yin等人通過對(duì)菌群16S rRNA基因的V3區(qū)域測(cè)序發(fā)現(xiàn)，高果糖喂養(yǎng)的大鼠體內(nèi)的機(jī)會(huì)致病菌-埃希氏桿菌屬和志賀氏菌屬明顯富集，但是在中藥治療后，機(jī)會(huì)致病菌的水平降至空白對(duì)照組水平。與此同時(shí)，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的益生菌Collinsella也在給藥組明顯增殖[14]。參苓白術(shù)散在治療腹瀉上效果顯著。通過對(duì)糞便微生物基因組成進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明藥物組中益生菌乳桿菌屬和雙岐桿菌屬占比顯著增高[15]。多糖部位對(duì)于腸道菌群的失調(diào)能起到一定的恢復(fù)作用。研究表明將香菇多糖用于調(diào)節(jié)腸道紊亂的小鼠后，小鼠腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量水平上調(diào)，機(jī)會(huì)致病菌腸桿菌和腸球菌的數(shù)量下降[16]。

1.2 中藥改善腸道菌群代謝

腸道菌群所含有的豐富的基因能夠?yàn)樗拗鞯母鞣N代謝通途提供功能酶體，參與到各種代謝過程，包括短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的產(chǎn)生，氨基酸(Amino acids,AAs)代謝，膽汁酸的合成，外來物質(zhì)的代謝[17]。在腸道與宿主的共代謝過程中，許多小分子物質(zhì)在宿主細(xì)胞和微生物群信息交換中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

短鏈脂肪酸是腸道菌群最重要的產(chǎn)物之一。它們通過激活G蛋白偶聯(lián)受體和抑制組蛋白脫乙酰酶的活性來調(diào)控肥胖、炎性腸病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[18]。短鏈脂肪酸是由腸道微生物菌產(chǎn)生的，其數(shù)量水平與代謝底物與腸道菌群的組成相關(guān)。陶金華等人采用氣相聯(lián)合火焰離子化檢測(cè)器，研究菊花多糖對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的治療機(jī)制，測(cè)定了腸道內(nèi)容物中SCFAs的含量變化，結(jié)果表明，多糖在不同程度上增加了結(jié)腸炎大鼠腸道內(nèi)SCFAs的含量，其中以乙酸、丙酸、異丁酸和丁酸的含量變化趨勢(shì)最為明顯[19]。王艷芳等人采用氣相色譜法，研究了何首烏及其主要成分二苯乙烯苷(TSG)作用于非酒精性脂肪肝大鼠，檢測(cè)了其腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的改變量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)何首烏總提物及各劑量都能不同程度的降低高脂飲食大鼠腸道內(nèi)的總短鏈脂肪酸的含量，同時(shí)降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟脂質(zhì)含量和內(nèi)毒素水平[20]。

氨基酸由腸道菌群分解外來物質(zhì)或由自身代謝產(chǎn)生。氨基酸去羧基反應(yīng)產(chǎn)生胺類物質(zhì)，去氨基反應(yīng)產(chǎn)生氨氣。芳香族類氨基酸能夠產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物——酚類和吲哚類物質(zhì)。組氨酸通過脫羧作用產(chǎn)生組胺，現(xiàn)有研究證明羅氏乳桿菌分泌的組胺可以抑制宿主淋巴細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，來起到一定的抗炎作用[21]。Shan Yin等人利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/QTOF-MS)的代謝組學(xué)分析方法檢測(cè)給予中藥大黃后對(duì)于大鼠腸道代謝產(chǎn)物的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吲哚類與酚類物質(zhì)含量增加，但是多胺類物質(zhì)，如腐胺等多種氨基酸的水平出現(xiàn)了下降[22]。耿曙光等人研究了安腸湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道代謝的改變，發(fā)現(xiàn)氨基酸、糖類代謝異常，并篩選出腺嘌呤、胞嘧啶、尿苷、等10種代謝物作為潰瘍性結(jié)腸炎腸道代謝的相關(guān)潛在標(biāo)志物[23]。

膽汁酸(或膽汁鹽)是由肝臟中產(chǎn)生膽固醇和膽汁轉(zhuǎn)換得到的類固醇酸，其主要功能是促進(jìn)膳食脂肪和新陳代謝，吸收脂溶性維生素和膽固醇。膽汁酸在一天中會(huì)參與到8次肝腸循環(huán)，此重要的代謝途徑由宿主和腸道菌群共同協(xié)作完成。膽汁酸在腸道中的轉(zhuǎn)換主要通過擬桿菌屬、真桿菌屬、梭菌屬的厭氧作用進(jìn)行的，并伴有與牛磺酸和甘氨酸結(jié)合的膽汁酸通過膽鹽水解酶發(fā)生早期分離，恢復(fù)成未結(jié)合的游離膽汁酸[24]。韓國(guó)超等人研究發(fā)現(xiàn)逍遙散加味對(duì)于慢傳輸便秘有很好的療效，能夠縮短胃腸傳輸時(shí)間，增加雄性大鼠膽汁分泌量和調(diào)節(jié)膽汁成分，通過利膽作用來促進(jìn)腸蠕動(dòng)和腸分泌，起到治療慢傳輸型便秘的作用[25]。高脂高膽固醇飲食會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腸道微生物群落失衡，黃連生物堿對(duì)高血脂小鼠體內(nèi)的膽汁酸肝腸循環(huán)具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。黃連堿生物堿的降血脂效果可通過調(diào)節(jié)肝臟中的膽汁酸受體，改善膽汁酸的肝腸循環(huán)，改善機(jī)體炎癥水平及調(diào)節(jié)腸道微生物菌群來實(shí)現(xiàn)。微生物群落的變化又會(huì)反過來影響腸道中膽汁酸的種類[26]。

2 腸道微生態(tài)組成分析技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

在19世紀(jì)，科學(xué)家們普遍采用體外培養(yǎng)的方法來培養(yǎng)和觀察腸道菌群，選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件分離樣品中的特定微生物，進(jìn)行培養(yǎng)并對(duì)得到的菌群種類進(jìn)行分析。Hirayama等在1989年采用該方法對(duì)大熊貓腸道菌群多樣性進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌為Streptococcus和Terobacteriaceaee[27]。培養(yǎng)菌株的優(yōu)勢(shì)在于它們的整體基因序列能夠簡(jiǎn)單有效地檢測(cè)出來，傳統(tǒng)培養(yǎng)與系統(tǒng)發(fā)育技術(shù)可以擴(kuò)展參考數(shù)據(jù)庫(kù)，并且將具體功能分配到相應(yīng)的微生物譜系，這對(duì)于宏基因組學(xué)的研究是非常必要的。賀立群[28]等人選取條件致病菌——銅綠假單胞菌，將其置于含有黃連、黃柏和焦梔子的稀釋液的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分離細(xì)菌沉淀和上清，檢測(cè)其標(biāo)志代謝物綠膿菌素和彈性蛋白酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪和黃柏能夠顯著抑制假單胞菌菌株的生長(zhǎng)，而焦梔子整體上未顯示出顯著的抑制生長(zhǎng)作用。Lagier等人[29]分離培育了31種新型的菌群，為基因組文庫(kù)增加了10000多條之前未檢測(cè)到的基因。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在耗時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)要求高、影響因素多等問題，且該方法只能培養(yǎng)活菌，但是對(duì)于死亡的細(xì)菌情況卻無(wú)法估計(jì)，導(dǎo)致所得結(jié)論不夠精準(zhǔn)。若只是僅僅局限于純培養(yǎng)的方法，也無(wú)法獲得可信度高的結(jié)果。如今，在研究腸道菌群的功能與結(jié)構(gòu)中，科學(xué)家們將分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合起來，對(duì)腸道菌群如何調(diào)控人體健康進(jìn)行了更深入的探索[30]。

2.2 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)是DNA測(cè)序的革命性技術(shù)創(chuàng)新，具有同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序和分析的功能，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物種基因組或轉(zhuǎn)錄組的深入研究，其深入并且快速的測(cè)序過程使之成為現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)能夠完整快速地完成對(duì)腸道微生物群落信息的采集與分析，完善人們對(duì)腸道菌群的認(rèn)識(shí)。以16S rDNA擴(kuò)增進(jìn)行的高通量測(cè)序分析主要用于微生物群落多樣性和構(gòu)成的分析。目前的生物信息學(xué)分析也可以基于16S rDNA測(cè)序?qū)ξ⑸锶郝涞幕驑?gòu)成和代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，大大拓展了我們對(duì)于環(huán)境微生物的微生態(tài)認(rèn)知。16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)可對(duì)16S rDNA/18S rDNA/ITS等序列進(jìn)行測(cè)序，能同時(shí)對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中的微生物群落組成以及相對(duì)豐度，該技術(shù)直接從環(huán)境樣本中擴(kuò)增核糖體rDNA高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，解決了大部分菌株不可培養(yǎng)的難題，已在腸道菌群的研究中取得了廣泛應(yīng)用，如證實(shí)不同人群(嬰兒、老年人、孕婦及同卵雙胞胎等)腸道菌群的差異[2,31]，不同疾病狀態(tài)下(肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝等)腸道菌群與正常人腸道菌群的差異[32-33]。

近十年來，研究者們利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)來研究中藥對(duì)腸道菌群的影響較為普遍。何旭云[34]等人基于16S rDNA測(cè)序的方法，分析了黃芪多糖對(duì)于高脂喂養(yǎng)小鼠腸道菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠增加擬桿菌門與厚壁菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度，降低變形菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度，并且能夠明顯抑制高脂喂養(yǎng)小鼠肥胖的形成，由此可推斷黃芪多糖的減肥作用可能與調(diào)節(jié)肥胖小鼠的腸道菌群有關(guān)。通過以糞便樣品中的DNA為模板，進(jìn)行16S rRNA基因V3區(qū)域的擴(kuò)增，趙立平團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群代謝障礙所產(chǎn)生的內(nèi)毒素能夠引起慢性炎癥，從而導(dǎo)致肥胖相關(guān)的代謝紊亂[35]。而全麥、傳統(tǒng)中藥及益生元組成的WTP食譜可以滿足營(yíng)養(yǎng)需要并平衡腸道菌群，幫助肥胖患者減輕體重。Li Gao等人[36]運(yùn)用SAMP8小鼠作為老年癡呆小鼠模型，用黃芩素溶液對(duì)其進(jìn)行灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照于模型組，給藥組腸道菌中的6個(gè)菌屬含量明顯改變，這些菌屬均與認(rèn)知能力相關(guān)，說明黃芩素能夠改善SAMP8小鼠衰老和認(rèn)知障礙。

2.3 宏基因組學(xué)

進(jìn)入21世紀(jì)來，宏基因組學(xué)開始應(yīng)用于復(fù)雜微生物菌群的研究，目前已取得了飛速的發(fā)展。從糞便中提取DNA，經(jīng)鳥槍測(cè)序后，將得到的基因序列，進(jìn)行生物學(xué)信息和多元統(tǒng)計(jì)分析，來獲取整個(gè)腸道菌群的功能情況。宏基因組的主要優(yōu)點(diǎn)在于其能夠允許同時(shí)檢測(cè)微生物的多樣性。從此技術(shù)方法中獲得的一些結(jié)論與看法，包括微生物編碼潛能的全部編目，健康人群與肥胖、炎癥性腸病和糖尿病患者的腸道菌的區(qū)別以及臨時(shí)檢測(cè)腸道菌群中病毒的情況。2005年Relman實(shí)驗(yàn)室和美國(guó)基因組研究所第一次全面開展人類腸道宏基因組學(xué)的研究，打開了對(duì)腸道微生物多樣性的認(rèn)識(shí)的一扇大門[37]。Tyakht等[38]通過對(duì)不同國(guó)籍人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同地域的人群腸道菌群存在明顯差異性，導(dǎo)致該現(xiàn)象的主要原因是飲食習(xí)慣的不同。Manichanh等首次采用宏基因組學(xué)方法，研究較正常人群，克隆恩病(Crohn's disease, CD)患者的糞便樣品中厚壁菌門的多樣性明顯減少，此外還發(fā)現(xiàn)了新菌種的存在，宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得對(duì)未知微生物的研究有了突破[39]。

基于宏基因組學(xué)分析技術(shù)，趙興兵[40]等人通過采集脾虛便秘模型的小鼠的腸道內(nèi)容物，提取腸道微生物宏基因組，進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛兩種湯劑對(duì)于脾虛便秘模型的小鼠腸道細(xì)菌多樣性有一定的調(diào)整作用。陶偉偉[41]等人從中藥配伍禁忌的角度出發(fā)，以腸道菌群為研究對(duì)象，結(jié)果表明千金子與甘草合用會(huì)使腸道菌群宏基因組結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，提高芳香氨基酸降解功能和黏液降解功能相關(guān)基因含量，從而增加腸源尿毒素等毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，引發(fā)或加重機(jī)體患病風(fēng)險(xiǎn)。郭抗蕭[42]使用抗生素建立菌群失調(diào)小鼠腹瀉模型，研究七味白術(shù)散治療菌群失調(diào)腹瀉的機(jī)理，提取腸道內(nèi)容物微生物宏基因組DNA，結(jié)果表明七味白術(shù)散對(duì)菌群失調(diào)腹瀉的小鼠腸道細(xì)菌群落具有恢復(fù)作用。

近十年來，第二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展比較成熟，其優(yōu)點(diǎn)為通量高、準(zhǔn)確性高、速度快及信息全，廣泛使用的第二代測(cè)序技術(shù)主要為Illumina HiSeq測(cè)序儀、454測(cè)序平臺(tái)等。二代測(cè)序完全能夠滿足常規(guī)微生物群體的物種分類研究、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、功能注釋，樣品間的物種或基因差異以及物種間的代謝網(wǎng)絡(luò)等分析。我們可以通過其深度挖掘具有應(yīng)用價(jià)值的基因資源，為研究和開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)提供有力支持。然而，分子研究手段有著與生俱來的局限性，例如DNA的提取效率會(huì)導(dǎo)致腸道菌群中的所有物種的基因無(wú)法被均勻提取。

3 腸道菌群代謝產(chǎn)物分析技術(shù)

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分?？蒲腥藛T通過利用高通量、高精確度、高靈敏度的現(xiàn)代分析儀器，如質(zhì)譜和核磁共振波譜，對(duì)人體的代謝產(chǎn)物如血液、尿液、糞便中的代謝物的組成和性質(zhì)進(jìn)行研究分析[43]。通過質(zhì)譜檢測(cè)儀和核磁共振等技術(shù)對(duì)生物樣品中的代謝物組成進(jìn)行分析，不僅能得到代謝物的整體組成變化，探討生物體與環(huán)境因子和遺傳因子的相關(guān)作用關(guān)系，還能夠更加深入地了解人體與微生物群的共代謝的關(guān)系[44-47]。代謝組學(xué)分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)。本文將集中討論基于質(zhì)譜與核磁共振波譜的代謝組學(xué)技術(shù)來描述腸道微生物群代謝與人體生理學(xué)之間的相互關(guān)聯(lián)。

3.1 非靶向代謝組學(xué)研究

非靶向代謝組學(xué)分析能夠快速給出樣品的代謝譜，并且能夠檢測(cè)到大量代謝產(chǎn)物。但是由于物質(zhì)理化性質(zhì)的多樣性以及樣品中代謝物濃度的差異性，所以很難僅用一臺(tái)儀器就對(duì)代謝物進(jìn)行全表征[48]。因此針對(duì)具體的分析和化學(xué)參數(shù)，需要不同的分析平臺(tái)來實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物代謝物的表征。代謝物的分離、檢測(cè)、表征得益于分析平臺(tái)的快速發(fā)展。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography Mass Spectrometry,GC-MS)被廣泛地用于臨床中分析尿液、血液及糞便中的揮發(fā)性成分，評(píng)估多種疾病中的生物標(biāo)志物。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid Chromatography Mass Spectrometry,LC-MS)對(duì)于樣品檢測(cè)覆蓋范圍更廣。高效液相色譜(High pressure LC,HPLC)以及超高效液相色譜(Ultra pressure LC,UPLC)具有更強(qiáng)的分離能力。檢測(cè)儀器包括核磁共振波譜(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)與高分辨質(zhì)譜如軌道離子阱(Orbitrap)、飛行時(shí)間質(zhì)譜(quadrupole time-of-flight,Q-TOF)等[49]。

吳丹[50]等人采用GC-MS分析人與大鼠糞便中的堿性和中性代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人由于個(gè)體受到環(huán)境、飲食、身體狀況等因素的影響，不同人的糞便樣品代謝物比例差異較大，例如對(duì)甲基苯酚、吲哚、3-甲基吲哚等等。大鼠由于環(huán)境與飲食等因素較一致，因此其糞便樣品代謝物比例差異相對(duì)較小。

Meng Yu等人[51]使用UPLC-Q-TOF/MS考察了柴胡疏肝散能否調(diào)節(jié)腸道微生物群失調(diào)后的宿主代謝情況。數(shù)據(jù)經(jīng)偏最小二乘分析后表明該復(fù)方能夠減少抗生素使用后的腸道紊亂。將鑒定代謝物結(jié)果與代謝通路分析關(guān)聯(lián)起來，發(fā)現(xiàn)了三條抗生素誘導(dǎo)腸道微生物失調(diào)的代謝通路：甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝，煙酸和煙酰胺代謝，膽汁酸代謝。同樣地，Man-Yun Chen[52]等人將三七皂苷與人體腸道菌群在體外共培養(yǎng)，利用HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分離并鑒定代謝產(chǎn)物，結(jié)果共鑒定出45種代謝物，其中人參皂苷F1、原人參三醇、人參皂苷Rh2、人參皂苷化合物K和原人參二醇含量最高。而且研究者發(fā)現(xiàn)由腸道菌群分泌的酶介導(dǎo)的去糖基化反應(yīng)是主要代謝途徑。

Lindsey等人[53]通過850MHz1H-NMR對(duì)腸道菌群失衡的小鼠的尿液與糞便的代謝物進(jìn)行檢測(cè)，在用恩諾沙星誘導(dǎo)的小鼠的糞便提取物中發(fā)現(xiàn)了八種差異代謝物。這些代謝物主要集中于氨基酸類和短鏈脂肪酸類。

考慮到對(duì)微生物代謝物的更全面的富集，還可以將兩種或兩種以上的分析平臺(tái)進(jìn)行聯(lián)用。鄭曉皎等人[54]將UPLC/QTOF-MS和GC/TOF-MS聯(lián)用，用代謝組學(xué)全譜分析方法檢測(cè)廣譜抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)的大鼠模型的尿液和糞便樣本代謝輪廓變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩百多個(gè)宿主與腸道菌群的共代謝物。Yuting Zhou等人[55]將1H-NMR與GC-MS進(jìn)行聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)由黃連引起的腹瀉所產(chǎn)生的差異性代謝產(chǎn)物，通過多變量統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了20個(gè)生物標(biāo)志物。這些物質(zhì)中馬尿酸、乳酸和α-酮戊二酸與腸道菌群失衡相關(guān)。目前，代謝組學(xué)的研究多集中于質(zhì)譜，因?yàn)槠溆懈訉挿旱膭?dòng)態(tài)范圍以及較高的靈敏度和選擇性。

3.2 基于質(zhì)譜的靶向代謝組學(xué)

靶向代謝組學(xué)是針對(duì)于具有特征化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，如脂質(zhì)、碳水化合物、氨基酸等等，來驗(yàn)證之前提出的科學(xué)假設(shè)和生物標(biāo)志物的針對(duì)性的研究。通過標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照使用，可以對(duì)分子代謝物進(jìn)行定量或者半定量。靶向代謝組學(xué)的分離平臺(tái)與非靶向代謝組學(xué)基本一致，但其檢測(cè)器主要為三重四級(jí)桿質(zhì)譜(Triple Quadrupole Mass,QQQ)和串聯(lián)四級(jí)桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(Triple Quadrupole Linear Ion Traps,QTrap)。這兩種質(zhì)譜能夠使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple-reaction monitoring,MRM)檢測(cè)母離子與特征子離子，具有反向抽提的作用，提高了檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的靈敏度和選擇性，適合對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析[56-57]。

為獲得更全面的膽汁酸表征，Jun Han等人[58]開發(fā)了UPLC-MRM-MS的檢測(cè)方法，用于對(duì)50種已知膽汁酸靶向定量檢測(cè)。除此之外，為表征其它潛在的膽汁酸，還可以用已知的特征離子進(jìn)行二級(jí)靶向掃描檢測(cè)。Waner Hou等人[59]對(duì)11種關(guān)鍵腸道微生物群-宿主共代謝物進(jìn)行快速定量，涉及到琥珀酸、苯乙酰谷氨酰胺、馬尿酸和三甲胺代謝途徑。該方法可用于綜合研究這些關(guān)鍵微生物群-宿主共代謝物的病理生理作用和機(jī)制，反映了腸道的功能，從而為評(píng)估腸道微生物群紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生，發(fā)展和治療效果提供了新的機(jī)會(huì)。

孟拓等人[60]建立了GC-MS的SCFAs分析方法，分析腸炎小鼠的SCFAs代謝情況。使用了三氟乙酰胺與SCFAs反應(yīng)，進(jìn)行衍生化，并通過了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，慢性腸炎小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中的SCFAs含量蓄積；盲腸內(nèi)容物中的SCFAs水平整體下調(diào)，乳酸蓄積，該結(jié)果表明腸炎小鼠腸道內(nèi)的脂肪酸代謝紊亂。陳蕾[61]利用GC-MS對(duì)小鼠糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于空白對(duì)照組，苦蕎組小鼠的糞便中的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的含量分別增加，表明苦蕎具有益生元作用。Wei Xu等人對(duì)含有伯胺、仲胺和酚羥基的代謝物進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，用衍生化的方法對(duì)糞便樣品中的此類化合物進(jìn)行化學(xué)垂釣，可以對(duì)含這三種官能團(tuán)的代謝物進(jìn)行亞組學(xué)表征[62]。歐陽(yáng)輝[63]運(yùn)用UPLC-Q-Trap-MS分析了白頭翁皂苷D在大鼠離體腸道菌群體外代謝產(chǎn)物，比較確定了白頭翁皂苷D在體外腸道菌群中能夠通過脫糖代謝及羥基化、甲基化、脫氫等代謝反應(yīng)，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，且白頭翁皂苷的代謝產(chǎn)物很有可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的起效物質(zhì)。

4 腸道微生態(tài)組成與菌群代謝產(chǎn)物分析技術(shù)聯(lián)用

為了更加深入了解腸道菌群與疾病的相關(guān)性，研究者們還會(huì)將基因組學(xué)與代謝組學(xué)進(jìn)行聯(lián)用，對(duì)腸道菌群的生態(tài)與代謝變化更加詳細(xì)地闡明。Jingcheng Xiao[64]等人利用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)與LC-triple-TOF/MS技術(shù)，分析三七皂苷對(duì)腸道菌群代謝的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七皂苷組的大鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物中大多數(shù)為去糖基化產(chǎn)物，與對(duì)照組大鼠相比暴露水平偏低；而去糖基化產(chǎn)物的暴露水平可能與糖苷酶活性及變形菌門相關(guān)，擬桿菌門上調(diào)可能增加腸道菌群的氧化還原酶活性。李松林團(tuán)隊(duì)[65]通過16S rRNA基因測(cè)序分析與UPLC-QTOF-MS代謝組學(xué)分析，研究了獨(dú)參湯里的多糖是如何通過腸道菌群重建機(jī)體的平衡。結(jié)果表明，人參多糖提高了腸道對(duì)特定人參皂苷的代謝和吸收功能，同時(shí)能恢復(fù)失衡的菌群，特別是能增加乳酸菌和擬桿菌的數(shù)量。

不同的分析平臺(tái)有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，未來關(guān)于腸道菌群的研究必將是多種組學(xué)技術(shù)的綜合分析。不同的分析平臺(tái)可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，盡可能的得到更多的菌群代謝產(chǎn)物信息與菌群微生物組成的物種信息。

5 小結(jié)與展望

腸道菌群的平衡狀況與宿主的健康和疾病有著密切的關(guān)聯(lián)，主要表現(xiàn)為正常生理狀態(tài)下與非正常生理狀態(tài)下菌群結(jié)構(gòu)與數(shù)量的差異(即微生物多樣性的差異)，以及腸道菌群代謝產(chǎn)物的差異。中藥通過調(diào)控腸道菌群中菌種結(jié)構(gòu)組成與微生物代謝產(chǎn)物，從而維持腸道微生態(tài)平衡，對(duì)胃腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎、便秘、克羅恩病)、代謝性疾病(肥胖、糖尿病、高血壓等)有著顯著的治療效果。近十年來，腸道菌群多樣性的分析方法以及代謝產(chǎn)物分析方法取得了很大突破，如基因組學(xué)、代謝組學(xué)和生物信息學(xué)等。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，中草藥調(diào)控腸道菌群的作用機(jī)制將進(jìn)行更加系統(tǒng)而深入的研究，這對(duì)于全面了解中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為中藥在調(diào)節(jié)腸道菌群方面取得新的突破性進(jìn)展，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化研究進(jìn)程具有重要的意義。