五類內(nèi)吸性殺菌劑在葡萄上的抗藥性研究

周連柱，孔繁芳，張昊，王忠躍*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

卵菌是一類重要的病原生物，包括霜霉、疫霉等重要病原菌，由卵菌引起的病害有霜霉病、疫病等，其危害作物種類多，流行速度快，造成的損失大。目前，生產(chǎn)上防治卵菌病害最普遍、最有效的方法還是化學(xué)防治。使用殺菌劑防治植物病害是保證農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要措施之一。早在20世紀(jì)70年代以前，人們就開始用殺菌劑來防治病害，最初使用的殺菌劑類型為傳統(tǒng)的保護(hù)性殺菌劑。保護(hù)性殺菌劑一般是在病原菌侵染植物前施藥，保護(hù)植物免受病原菌的侵染為害，主要起表面保護(hù)作用，其作用位點(diǎn)多，藥劑一般不進(jìn)入植物體內(nèi)，不易引發(fā)病菌對其產(chǎn)生抗藥性。直到20世紀(jì)60年代末70年代初，大量的高效、內(nèi)吸、選擇性強(qiáng)的殺菌劑被相繼開發(fā)和廣泛應(yīng)用。生產(chǎn)上防治卵菌病害常用的內(nèi)吸性殺菌劑主要為甲氧基丙烯酸酯（QoI）類；羧酸酰胺類（CAAs）；苯基酰胺類（PAFs）；氰基乙酰胺類和磺胺咪唑類五大類[1-3]。隨著內(nèi)吸性殺菌劑的使用量增加、使用范圍增大，病菌產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象頻頻被報道；抗藥性產(chǎn)生導(dǎo)致的化學(xué)防治失效，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受巨大的損失[4-6]。因此，了解和掌握病原菌的抗性頻率、抗性水平是抗藥性治理、成功防控、化學(xué)農(nóng)藥科學(xué)使用的基礎(chǔ)，也是我國“化學(xué)肥料和農(nóng)藥減施增效，農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展”戰(zhàn)略的必然要求。

1 殺菌劑的抗性現(xiàn)狀

1.1 苯基酰胺類殺菌劑

苯基酰胺類殺菌劑（Phenylamides，PAFs）主要包括甲霜靈、苯霜靈和惡霜靈。這三種藥劑之間存在交互抗性，其中甲霜靈應(yīng)用最為頻繁和普遍，抗藥性的研究與監(jiān)測也最為深入透徹。甲霜靈最早于1970年被引入作為系統(tǒng)殺菌劑防治卵菌病害，被廣泛用于防治致病疫霉和霜霉所引起的病害。1978年以色列用該藥防治黃瓜霜霉病，一年后，經(jīng)檢測病菌對甲霜靈的抗藥性水平高達(dá)500倍以上。1979年，荷蘭和愛爾蘭用甲霜靈防治馬鈴薯晚疫病，發(fā)現(xiàn)病原菌普遍對其產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致晚疫病大面積流行爆發(fā)。據(jù)Fourie等[7]報道，南非地區(qū)葡萄霜霉病對甲霜靈藥劑的抗性頻率已達(dá)94.2%。在國內(nèi)，使用甲霜靈防治卵菌病害的許多地區(qū)病菌都產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[8-9]。Sun等[10]采用傳統(tǒng)葉盤法檢測了2007—2008年間我國7省11個地區(qū)葡萄霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性，結(jié)果顯示，392菌株中有13%為敏感菌株，26%表現(xiàn)為低抗，61%為高抗，可見國內(nèi)葡萄霜霉菌對甲霜靈已普遍產(chǎn)生抗藥性。祝海娟等[11]采用葉盤漂浮法測定了國內(nèi)8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性，結(jié)果有91.7%表現(xiàn)高抗，8.3%表現(xiàn)中抗，無敏感和低抗菌株。

1.2 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（Strobilurins，QoIs）是一類能夠有效控制子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌為害的廣譜性殺菌劑。其代表藥劑為嘧菌酯，主要作用是抑制孢子萌發(fā)，游動孢子的釋放和游動，對病害無治療作用[12]。該類藥劑于1996年進(jìn)入市場用于防治小麥白粉病，兩年后在德國北部3個地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了抗QoI類殺菌劑的抗性菌株，抗性倍數(shù)大于500，抗藥性菌株在群體中的頻率高達(dá)90%。1999年在法國和意大利相繼檢測到對QoI類殺菌劑具有抗性的葡萄霜霉菌株，隨后歐洲在2000年檢測到對嘧菌酯具有抗性的葡萄霜霉病菌[13]。同年，在德國的其它地區(qū)及法國、比利時、英國和丹麥也監(jiān)測到抗藥性個體[14]。張艷菊等[15]測定了我國8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)霜霉菌對嘧菌酯的抗藥性，結(jié)果顯示無高抗菌株的存在，其中山東省菌株對嘧菌酯的抗性水平最高，其他省份抗性水平相對較低。王喜娜[16]2014年在河北永清縣葡萄園中監(jiān)測到抗性菌株的存在，這也是中國首次報道發(fā)現(xiàn)葡萄霜霉菌對嘧菌酯產(chǎn)生抗性。

1.3 羧酸酰胺類殺菌劑

羧酸酰胺類殺菌劑（Carboxylic acid amides，CAAs）是生產(chǎn)上用于替代苯基酰胺類殺菌劑，為緩解甲霜靈藥劑的抗藥性而研發(fā)的一類結(jié)構(gòu)新穎的藥劑。烯酰嗎啉是該類藥劑中最早研發(fā)成功的一種，20世紀(jì)80年代由美國氰氨公司研發(fā)并投入市場，對霜霉病和晚疫病有特效。烯酰嗎啉于1988年投入市場，1994年，Albert等[17]就報道在法國地區(qū)出現(xiàn)了對該藥劑敏感性降低的葡萄霜霉病菌群體；隨后，在法國葡萄園中發(fā)現(xiàn)了抗烯酰嗎啉的葡萄霜霉病菌株[18]。2005年，在法國的東西南部等多個地區(qū)相繼監(jiān)測到對烯酰嗎啉敏感性下降的病菌，但抗藥性頻率都較低，并且抗性群體的比例隨地區(qū)和年份的不同波動很大。對羧酸酰胺類殺菌劑的田間抗藥性監(jiān)測結(jié)果表明[19]，歐洲的主要葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉仍然呈現(xiàn)中高等水平抗藥性風(fēng)險；意大利、德國、瑞士等國也均存在抗性群體，希臘和中國尚未檢測到抗性群體。在中國，2010年Sun等[10]對采自全國7省11個地區(qū)采集的葡萄霜霉菌進(jìn)行烯酰嗎啉敏感性測定，未發(fā)現(xiàn)抗性菌株。至2014年，中國未見有關(guān)葡萄霜霉菌以及瓜果疫霉菌對烯酰嗎啉產(chǎn)生抗藥性的報道[20]。王喜娜等[21]報道在2015年廣西資源縣的葡萄霜霉病菌株中發(fā)現(xiàn)了對烯酰嗎啉具有抗藥性的菌株，這是國內(nèi)首次關(guān)于葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉具有抗性的報道。

1.4 氰基乙酰胺類殺菌劑

霜脲氰（Cymoxanil），是20世紀(jì)70年代末被研發(fā)并廣泛應(yīng)用于葡萄的一類系統(tǒng)防治卵菌病害的殺菌劑。在歐洲，使用霜脲氰防治葡萄霜霉病已有30多年的歷史，大多數(shù)是采用和其他殺菌劑混合來防治該病害[22]。霜脲氰對霜霉病和晚疫病有特效，有相當(dāng)長一段時間，霜脲氰被認(rèn)為是一類具有低風(fēng)險抗性的殺菌劑。然而，自20世紀(jì)90年代起，抗性菌株在意大利北部的兩個葡萄園中被檢測到。Sujkowski等[23]測定了來自墨西哥中部和北部的75個在遺傳上具有多樣性的致病疫霉菌株對霜脲氰的敏感性，結(jié)果表明各菌株對霜脲氰均表現(xiàn)敏感，且菌株間差異很小，EC50值在0.1～1.0 μg/mL。霜脲氰自20世紀(jì)90年代初開始在中國大量使用，大部分地區(qū)的用藥歷史在10年以上。王文橋等[24]報道，致病疫霉野生型菌株NS1經(jīng)紫外線誘變及亞致死劑量的霜脲氰連續(xù)選擇10代，均未產(chǎn)生對霜脲氰的抗性，認(rèn)為疫霉菌對霜脲氰產(chǎn)生抗性的固有風(fēng)險較小。羅赫榮等[25]用亞硝基胍誘變辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的游動孢子，篩選出29株抗甲霜靈、6株抗霜脲氰的突變菌株，并證明突變菌株的抗藥性經(jīng)無性和有性生殖均可穩(wěn)定遺傳。生產(chǎn)上，霜脲氰主要是同其他殺菌劑一起混合使用，很少單一使用，這在一定程度上降低了病原菌對其產(chǎn)生抗藥性的機(jī)率。2015年，Toffolatti等[26]通過卵孢子萌發(fā)試驗(yàn)對意大利的葡萄霜霉菌對霜脲氰殺菌劑的敏感性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，病菌對該藥劑的EC50值低于10μg/mL，采集的樣品中抗性菌株僅為16%，且只有3株菌株表現(xiàn)為高抗，并且在停止使用霜脲氰藥劑后菌株能恢復(fù)其敏感性。國內(nèi)對霜脲氰的抗藥性研究相對較少，但殺菌劑防效頻頻下降的現(xiàn)象使得抗藥性研究迫在眉睫。

1.5 磺胺咪唑類殺菌劑

磺胺咪唑類殺菌劑代表藥劑為氰霜唑，作為對卵菌綱病害有特效的一款藥劑，氰霜唑?qū)λ共　⒁卟∮辛己玫男Ч?。并且與市場上的苯酰胺類、羧酸酰胺類殺菌劑無交互抗性。目前市場上使用的多為其復(fù)配產(chǎn)品，多與烯酰嗎啉、嘧菌酯等藥劑制成混劑使用。國內(nèi)外對氰霜唑抗藥性的研究相對較少，2008年Kousik等[27]首次報道美國東南部疫霉抗性菌株的存在，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株EC50值為3.8～535μg/mL，部分菌株高達(dá)1000μg/mL。2012年，Jackson等[28]通過對美國喬治亞州辣椒疫霉對氰霜唑、雙炔酰菌胺和烯酰嗎啉三種藥劑的混劑的抗藥性進(jìn)行檢測，在三種藥劑單獨(dú)使用的情況下，通過菌絲生長、孢子萌發(fā)等方法檢測菌株抗藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株對雙炔酰菌胺和烯酰嗎啉均較敏感，而對氰霜唑已產(chǎn)生一定程度的抗藥性，菌絲生長法和孢子萌發(fā)法測定結(jié)果顯示其最小抑制濃度（MIC）已達(dá)500 μg/mL，但混合物對孢子的萌發(fā)有很高的抑制作用，其平均EC50值僅為 0.04μg/mL，可見氰霜唑單獨(dú)使用抗藥性風(fēng)險較高。

2 抗性類型和抗性機(jī)制

2.1 苯基酰胺類殺菌劑

苯基酰胺類殺菌劑（Phenylamides，PAFs）的主要作用方式是抑制蛋白質(zhì)及RNA的生物合成，特異性地抑制核糖體RNA聚合酶Ⅰ的活性，對植物病害的各主要生長階段如菌絲生長、吸器形成及孢子囊產(chǎn)生均具有很好的抑制作用。甲霜靈（Metalaxyl）為這類殺菌劑的代表。

對苯基酰胺類殺菌劑的抗藥性研究已有一定的歷史，大量的研究表明，卵菌對甲霜靈的抗藥性是由單個主效基因控制的質(zhì)量遺傳性狀，但病菌基因組中的抗性相關(guān)基因和抗性突變位點(diǎn)目前還尚不明確。2014年Randall等[29]報道，甲霜靈的抗性與編碼RNA聚合酶Ⅰ大亞基RPA190基因單核苷酸多態(tài)性SNP T1145A位點(diǎn)的突變相關(guān)，T和A分別代表敏感和抗性兩種類型，當(dāng)該位點(diǎn)的堿基T突變?yōu)锳時會造成絡(luò)氨酸被苯丙氨酸替代，最終導(dǎo)致RPA190等位基因由抗藥型變?yōu)槊舾行?。同年后續(xù)的試驗(yàn)表明，只有少數(shù)的抗性菌株在1145位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性變化，這與1999年Judelson等[30]報道中甲霜靈的抗藥性不是由單一位點(diǎn)控制的結(jié)果相一致。2015年Michael[31]通過DNA測序、SNP和高分辨率溶解曲線（HRM）試驗(yàn)證明，RPA190等位基因的SNP T1145A位點(diǎn)的變化與甲霜靈抗藥性的變化不一致，指出用RPA190基因的變化不能夠充分診斷田間菌株對甲霜靈的敏感性水平。劉洪斌等[32]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對甲霜靈抗性和敏感的馬鈴薯晚疫病菌雜交后F1代主要為中抗類型，兩個中抗F1代雜交后代F2中的抗、中抗、敏感菌株的比例為1∶2∶1，表明病原菌對苯基酰胺類殺菌劑的抗藥性是由單個主效基因控制。

2.2 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（Strobilurins，QoIs）代表藥劑嘧菌酯是一種高選擇性單一位點(diǎn)抑制劑，其通過與線粒體呼吸鏈中細(xì)胞色素b、c1復(fù)合物中的Qo位點(diǎn)結(jié)合，從而達(dá)到阻礙電子傳遞、影響線粒體的呼吸作用的目的。大量的試驗(yàn)表明，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗藥性屬于質(zhì)量遺傳抗藥性，在大多數(shù)病原菌中，細(xì)胞色素b基因中存在兩種主要的突變導(dǎo)致產(chǎn)生抗藥性，分別為143位甘氨酸被丙氨酸替代和129位苯丙氨酸被亮氨酸替代（G143A、F129L），143位甘氨酸被丙氨酸替代這種情況最為普遍[33]。在對細(xì)胞色素b基因143位氨基酸突變的研究中發(fā)現(xiàn)，從遺傳學(xué)角度看存在4種主要的單倍型差異，這表明葡萄霜霉菌群體抗性至少存在兩種不同的起源。在法國霜霉菌抗藥性檢測中單倍型I（IS、IR）和單倍型II（IIS、IIR）的抗性頻率分別達(dá)到了75%和25%，并且這種分布差異很大[34]。

2.3 羧酸酰胺類殺菌劑

羧酸酰胺類殺菌劑（Carboxylic acid amides，CAAs）能夠抑制病原菌的菌絲生長、孢子囊及休止孢的萌發(fā)、卵孢子或孢子囊的形成，但是對游動孢子的游動、釋放以及休止孢的形成無抑制作用[35]。烯酰嗎啉為該類殺菌劑的代表，其作用機(jī)制是破壞病菌細(xì)胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解，而使病菌死亡。

生物學(xué)試驗(yàn)研究表明，病原菌對烯酰嗎啉的抗藥性主要與纖維素合酶基因1105位點(diǎn)堿基突變有關(guān)。大量的試驗(yàn)表明，病菌自然狀態(tài)下纖維素合酶PcCesA3基因在1105位的密碼子為GGC，編碼甘氨酸（GLy），在接觸大量的烯酰嗎啉藥劑后，該位點(diǎn)已發(fā)生堿基突變，由原來的GGC突變?yōu)锳GC編碼絲氨酸（Ser）或者突變?yōu)镚TC編碼纈氨酸（Val）[36-37]。并且發(fā)現(xiàn)在所有對烯酰嗎啉敏感的菌株中，在1105位點(diǎn)編碼的氨基酸為GLy/GLy、GLy/Val、GLy/Ser，而在抗烯酰嗎啉的菌株中，在病菌的纖維素合酶PcCesA3基因的1105位點(diǎn)編碼的氨基酸為Ser/Ser、Val/Val、Ser/Val，即只有病菌在該位點(diǎn)發(fā)生純合突變，病菌才會由原來的對烯酰嗎啉敏感轉(zhuǎn)變?yōu)榭剐?，雜合突變只是抗性攜帶者并不表現(xiàn)為抗性[38-39]。

2.4 氰基乙酰胺類殺菌劑

霜脲氰（Cymoxanil）對病菌的各個生命活動進(jìn)程均有影響，孢子囊萌發(fā)以及游動孢子釋放游動等一系列生物學(xué)試驗(yàn)證明，霜脲氰在核酸和氨基酸的生物合成等一些二級反應(yīng)過程發(fā)揮重要作用。另一方面霜脲氰對DNA合成過程的影響明顯大于RNA合成的影響，但主要的作用位點(diǎn)、作用機(jī)制目前仍是未解之謎[40]。

2.5 磺胺咪唑類殺菌劑

氰霜唑（Cyazofamid）是一種保護(hù)性殺菌劑，通過結(jié)合細(xì)胞色素b、cl復(fù)合體中的Qi位點(diǎn)阻斷卵菌線粒體細(xì)胞色素b、cl絡(luò)合物中的電子傳遞來干擾能量供應(yīng)。它的作用部位是在酶的Qi中心，這種作用機(jī)制不同于其他傳統(tǒng)殺菌劑，包括甲氧基丙烯酸酯類。氰霜唑通過干擾能量供應(yīng)可以阻礙游動孢子萌發(fā)、游動至孢子囊形成的各個生育階段，從而達(dá)到預(yù)防和控制病害蔓延的目的[41]。對霜霉病、晚疫病和十字花科根腫病有特效。通過在試驗(yàn)中額外添加ATP，降低氰霜唑的藥效，表明氰霜唑的作用方式與ATP能量供應(yīng)系統(tǒng)緊密相連[42]。2014年，Li等[43]開展了抗霉素和氰霜唑兩種Qi位點(diǎn)抑制劑的抑制動力學(xué)對比試驗(yàn)，結(jié)果表明，抗霉素屬于疏松性位點(diǎn)結(jié)合抑制劑，而氰霜唑則是緊密型位點(diǎn)結(jié)合抑制劑，其與Qi位點(diǎn)結(jié)合緊密，是一種典型的Qi位點(diǎn)抑制劑。

3 抗藥性檢測方法

3.1 傳統(tǒng)檢測方法

葡萄霜霉病對殺菌劑的抗藥性檢測方法通常采用傳統(tǒng)葉盤漂浮法[7]，以鮮嫩易感病的葡萄葉片作為試驗(yàn)材料，一般為‘里扎馬特’‘赤霞珠’‘玫瑰香’等易感品種，先用1%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，30 s后用去離子水清洗，然后在超凈工作臺中用打孔器打成15 mm葉盤，試驗(yàn)過程中將葉盤漂浮在裝有藥液的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿10個葉盤，對照組采用無菌水代替藥液，根據(jù)發(fā)病情況判斷抗藥性情況。

甲霜靈（Metalaxyl）目前主要采用此方法進(jìn)行抗藥性檢測，其普遍使用敏感檢測濃度MIC（0.1 μg/mL）作為敏感參考標(biāo)準(zhǔn)用于判斷其他試驗(yàn)的敏感性情況[44]，根據(jù)Stahle-Csech的抗性因子檢測標(biāo)準(zhǔn)[45]，RF＞100即表示產(chǎn)生了抗性，定義當(dāng)MIC＝1 μg/mL、RF＝10時為敏感菌株；當(dāng)MIC＝10 μg/mL、RF＝100時為低抗；當(dāng)MIC＝100 μg/mL、RF＝1000時為抗性；當(dāng)MIC ≥200 μg/mL、RF≥200時為高抗。在葡萄霜霉菌對甲霜靈的抗藥性試驗(yàn)中，采用MIC為10 μg/mL和100 μg/mL兩個明顯的檢測濃度標(biāo)準(zhǔn)[7]，即菌株在空白對照組中發(fā)病且在10 μg/mL藥液濃度下未發(fā)病，定義為敏感菌株；在10 μg/mL藥液濃度下發(fā)病，但在100 μg/mL藥劑濃度下未發(fā)病的菌株定義為低抗菌株；在100 μg/mL藥劑濃度下發(fā)病的菌株定義為高抗。這套檢測體系一直作為檢測甲霜靈抗藥性的標(biāo)準(zhǔn)體系沿用至今。

嘧菌酯（Azoxystrobin）抗藥性檢測目前有兩種主要的方法，傳統(tǒng)葉盤漂浮法和分子檢測技術(shù)，在傳統(tǒng)檢測方法中，根據(jù)Wong等[46]的報道，葡萄霜霉菌對嘧菌酯藥劑的EC50值范圍為0.04～0.94 μg/mL，均值0.40 μg/mL。傳統(tǒng)葉盤法進(jìn)行霜霉菌對嘧菌酯抗性檢測所用的鑒別濃度為1000 μg/mL[47]，定義菌株在1000 μg/mL藥液濃度下發(fā)病即產(chǎn)生了抗藥性。

烯酰嗎啉（Dimethomorph），目前有兩種主要的抗藥性檢測方法，傳統(tǒng)葉盤漂浮法和分子檢測技術(shù)。據(jù)Sun等[10]的報道，葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉的EC50值范圍為0.01～0.21 μg/mL，均值為0.11 μg/mL，傳統(tǒng)葉盤法進(jìn)行葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉抗性檢測標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.6 μg/mL，當(dāng)MIC＞1.6 μg/mL即為抗性個體，當(dāng)MIC＜1.6 μg/mL為敏感個體。

霜脲氰（Cymoxanil），目前沒有明確統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，其作用的方式也尚未知曉，研究中一般主要采用傳統(tǒng)的葉盤漂浮法進(jìn)行抗藥性初步判定。在已報道的文獻(xiàn)中將參考菌株的MIC值3 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)參考基線，以此為標(biāo)準(zhǔn)測定試驗(yàn)菌株的抗性因子，抗性因子RF≥10即表示產(chǎn)生了抗性；田間用藥的標(biāo)準(zhǔn)參考基線為120 μg/mL，可用此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間或者栽培植株整體抗藥性試驗(yàn)[48]。

氰霜唑（Cyzaofamid）一般作為混劑使用，國內(nèi)外研究報道都較少，抗藥性檢測所使用的方法也只有傳統(tǒng)的檢測方法。2001年，有研究報道通過菌絲生長法測定疫霉菌對氰霜唑的EC50值為0.008～0.2 μg/mL，對游動孢子釋放的MIC為0.1 μg/mL[41]。2012年研究報道氰霜唑?qū)苯诽烤也【木z生長MIC值達(dá)到500 μg/mL，但游動孢子囊萌發(fā)試驗(yàn)顯示其EC50值為0.007～0.008 μg/mL[28]。關(guān)于葡萄霜霉病對氰霜唑的抗藥性相關(guān)研究還較少，其抗藥性檢測標(biāo)準(zhǔn)，MIC以及EC50值等目前尚未明確，有待進(jìn)一步探索。

這些傳統(tǒng)的檢測方法存在周期長、效率低、工作量大且穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。由于葡萄霜霉菌為專性寄生菌，培養(yǎng)條件較為嚴(yán)苛且培養(yǎng)周期較長，因此采用傳統(tǒng)方法檢測其抗藥性不僅耗費(fèi)時間而且其結(jié)果受培養(yǎng)條件和藥劑的質(zhì)量影響較大。隨著殺菌劑的作用方式和抗性機(jī)理不斷被揭示，根據(jù)殺菌劑的抗性機(jī)制，越來越多的分子檢測技術(shù)被相繼開發(fā)應(yīng)用，傳統(tǒng)的檢測方法也逐漸被現(xiàn)代的分子檢測技術(shù)替代。

3.2 分子檢測技術(shù)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，殺菌劑的作用機(jī)理以及病原菌的抗性機(jī)制相繼被揭示，核酸水平的分子檢測技術(shù)已成功應(yīng)用于已明確抗藥性突變位點(diǎn)的病原菌田間早期的抗性菌株的快速、準(zhǔn)確檢測以及監(jiān)測抗藥性群體的發(fā)展動態(tài)等。應(yīng)用此方法的一個重要前提是殺菌劑的機(jī)制以及病原菌的抗藥性突變位點(diǎn)必須明確清晰，因此，目前該技術(shù)還處于初步發(fā)展階段，許多殺菌劑的機(jī)理以及對應(yīng)的病原菌抗藥性突變機(jī)制還尚不清晰。

隨著部分殺菌劑的抗性機(jī)制的明確，分子檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于抗性頻率的檢測。目前，用于檢測殺菌劑抗性的分子技術(shù)層出不窮，如突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS）、PCR-RFLP和nested PCR-RFLP技術(shù)、高分辨率溶解曲線（HRM）、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（LAMP）、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探針實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù)等[49-51]。Aoki等[52-53]根據(jù)葡萄霜霉菌對羧酸酰胺類殺菌劑產(chǎn)生抗性后的單核苷酸點(diǎn)突變這一原理，開發(fā)了PCR-RFLP抗藥性分子檢測技術(shù)，顯著提高了檢測效率。Zhang等[54]基于葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉抗性突變位點(diǎn)，建立了Tetra-primers ARMS PCR檢測方法。Taqman-MGB探針實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)是一項(xiàng)靈敏度高、特異性強(qiáng)的分子檢測技術(shù)，MGB分子的存在使得Taqman探針與互補(bǔ)的DNA 鏈結(jié)合更為特異。因此，探針可以識別出DNA鏈中的單個堿基變化[55]。郭慶[56]利用Taqman-MGB探針實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù)對葡萄根瘤蚜進(jìn)行檢測，證明了該方法的特異性，靈敏度可達(dá)1.625拷貝/μL。金麗蘭等[57]利用該技術(shù)分析了YP3A5基因rs776746位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)對于CYP3A5 rs776746位點(diǎn)基因型的區(qū)分效率極高，最低檢測含量僅為0.01 ng，具有較好的特異性和靈敏度。這些方法各有優(yōu)勢與缺點(diǎn)，因根據(jù)自身研究的目的合理選擇相應(yīng)的方法。

4 展望

目前，生產(chǎn)上用于防治卵菌的五大類主要內(nèi)吸性殺菌劑中，只有羧酸酰胺類殺菌劑中的烯酰嗎啉和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中的嘧菌酯的病原菌抗性機(jī)制和抗藥性突變位點(diǎn)已經(jīng)明確[58-59]。常用的檢測這兩種藥劑抗藥性的方法主要為 PCR-RFLP和Nested PCR-RFLP技術(shù)、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探針實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù)。對于甲霜靈、霜脲氰和氰霜唑這3種藥劑其病原菌抗性機(jī)制還在研究探索中。目前，代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于甲霜靈抗藥性的檢測，通過測定甲霜靈用藥前后病原菌體內(nèi)各組分的代謝變化來辨別抗性菌株和敏感菌株。Pomerantz等[60-61]報道，使用紅外光譜圖探測技術(shù)測定了疫霉菌在使用甲霜靈前后的主要物質(zhì)變化，用于判定菌株是否對藥劑產(chǎn)生抗藥性。隨著科技的快速發(fā)展，各藥劑的作用機(jī)制、抗性突變機(jī)制以及病原菌抗藥性問題都將一一被解決。