乳酸菌口服疫苗在豬病防治中的應用

李俊霞 藺曉月 孫圣福 陳靜 田夫林 李云崗 張月

（山東省動物疫病預防與控制中心 250031）

乳酸菌是一種革蘭氏陽性菌，可以發(fā)酵碳水化合物生成大量的乳酸，具有雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌等十幾個屬。在人體、大部分動物腸道中，乳酸菌是非常常見的一種細菌。乳酸菌沒有致病性，被應用于食品工業(yè)等領域中，是一種公認的安全級微生物。雙歧菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬等因與益生作用具有密切關系，受到人們的廣泛重視。乳酸菌可在黏膜部位、生殖系統(tǒng)、泌尿、胃腸道等中黏附存活，并且沒有病原性，利用乳酸菌的這一特點進行了大量的活菌口服疫苗研究，并且受到廣泛關注。

口服疫苗利用胃腸黏膜來遞呈抗原，經(jīng)過不同的免疫通路，能產(chǎn)生和常規(guī)注射相似的免疫反應。在醫(yī)學、分子生物學快速發(fā)展的背景下，有關口服疫苗在黏膜抗原遞呈的研究有了突破性的發(fā)展，可以誘導機體產(chǎn)生有效的免疫應答與免疫耐受。

1 乳酸菌表達系統(tǒng)的特點

近年來，在研究疫苗傳遞系統(tǒng)方面，研究人員迫切找到一種傳遞載體，可以在機體內(nèi)長時間存在、不會對機體產(chǎn)生損害，并且可以產(chǎn)生持續(xù)免疫力。作為原核表達系統(tǒng)中的一種，在表達外源基因方面乳酸菌表達系統(tǒng)具有以下幾個特點：（1）一些菌種自身攜帶大量染色體外因子，比較容易發(fā)展新的表達載體系統(tǒng)；（2）培養(yǎng)簡便，遺傳操作方法效率高、已經(jīng)較為成熟，具有良好的重復率；（3）乳酸菌是食品級的細菌，能構(gòu)建食品級的表達系統(tǒng)和基因克隆，促進基因工程相關產(chǎn)品安全性的提高；（4）本底表達水平比較低，表達量相對較高，純化簡單；（5）該系統(tǒng)的啟動子系統(tǒng)能進行高度調(diào)控，且能表達毒素基因；（6）在細胞內(nèi)、細胞外均能表達，并且可以分泌到細胞外；（7）乳酸菌無內(nèi)毒素、比較安全，其表達的外源蛋白不用進行純化便能和菌體一起服用；（8）乳桿菌等菌株對機體黏膜有非常強的黏附作用，乳酸菌表達與治療或免疫作用的蛋白可以源源不斷在黏膜處生產(chǎn)，持續(xù)向機體釋放目的抗原蛋白，能有效引起機體的免疫應答和免疫耐受，提高對人、畜的免疫作用，是一種極具廣泛應用前景的、理想的抗原呈遞載體。

2 乳酸菌口服疫苗的作用機理

乳酸菌口服疫苗是以乳酸菌作為載體菌，利用基因工程技術重組病毒、細菌或寄生蟲等病原基因，構(gòu)建能表達外源抗原或攜帶外源DNA 疫苗的重組乳酸菌。這些重組菌能通過口服或滴鼻的途徑將抗原傳遞至宿主黏膜系統(tǒng)，進而在黏膜水平刺激免疫宿主產(chǎn)生免疫反應。其可同時激發(fā)機體體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫應答，且免疫過程和病原感染一致，能在黏膜水平預防病原感染。重組乳酸菌不僅具有疾病預防作用，對已發(fā)生的病毒感染同時具有一定的治療和抑制作用。下文主要闡述了乳酸菌在幾種常見豬病預防中的研究和應用。

3 乳酸菌口服疫苗在豬病防治中的應用

3.1 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，主要特征是引起豬的食欲不振、嘔吐、腹瀉，不同日齡的豬發(fā)病時的臨床癥狀不盡相同，發(fā)病仔豬多數(shù)會因脫水導致死亡[1]。當前豬流行性腹瀉發(fā)病率居高不下，臨床癥狀也愈來愈復雜，時常出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來嚴重危害，因而其疫苗的研制備受廣大研究者重視。張月構(gòu)建攜帶PEDV S 基因和復制子基因Rep.8014的 pRc/CMV2-S1-Rep.8014 和 pRc/CMV2-S2-Rep.8014 重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入乳酸菌中，得到重組乳酸桿菌疫苗。通過多組動物實驗的口服免疫，發(fā)現(xiàn)重組乳酸桿菌口服疫苗不僅能激發(fā)小鼠的體液和細胞免疫，而且能刺激腸道局部免疫應答[2]。另外，有研究從健康豬體內(nèi)分離篩選thyA 基因缺陷型乳酸桿菌，構(gòu)建含有PEDV 主要保護性抗原基因的以thyA 基因為選擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達載體，轉(zhuǎn)入乳酸桿菌，制備基因工程乳酸桿菌口服疫苗[3]。

3.2 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE）是一種急性、高接觸性腸道傳染病，由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of pigs，TGEV）引起，病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水，多與豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒和致病性大腸桿菌等病院混合感染，一般不易診斷鑒別[4]。各種年齡及品種的豬對TGEV 均容易感染，特別是2 周齡以下的仔豬感染后死亡率高達100%。豬傳染性胃腸炎呈世界性分布，給各國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來非常嚴重的經(jīng)濟損失。黃海楠等構(gòu)建含TGEV S 基因AD 片段的載體，并轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中表達，制備乳酸菌口服疫苗，免疫小鼠，經(jīng)細胞免疫和體液免疫檢測，結(jié)果表明，這一乳酸桿菌口服疫苗具有比較好的免疫效果[5]。

3.3 豬輪狀病毒病

豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus，PRV）是呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一，該病在世界范圍內(nèi)分布，其感染引發(fā)的腹瀉已發(fā)展成為一種世界性的疾病，給世界各地畜牧業(yè)造成嚴重的損失。1～4 周齡仔豬的發(fā)病率超過80%，死亡率可達20%。研究者們分別構(gòu)建含有豬輪狀病毒VP4、VP6、VP7 蛋白的重組乳酸菌，用其誘導小鼠產(chǎn)生明顯的血清和黏膜抗體，從而促進小鼠細胞免疫和體液免疫[6-8]。

3.4 豬細小病毒病

豬細小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）屬于細小病毒科細小病毒屬，臨床癥狀主要是引起初孕母豬的繁殖障礙，導致仔豬皮膚炎癥和腸炎性腹瀉。這種疾病在臨床表現(xiàn)和病理特點上不盡相同[9]。目前，PPV 與其他病毒混合感染發(fā)生較多，是導致很多疾病綜合征的病原之一。徐義剛等構(gòu)建的分泌型重組豬細小病毒VP2 基因的重組干酪乳桿菌免疫小鼠能產(chǎn)生明顯的抗PPV 抗體水平，表明分泌型的重組乳酸菌作為口服疫苗載體具有更好的免疫原性[10]。另外，王相清等構(gòu)建了重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）和豬細小病毒VP2 蛋白的干酪乳桿菌細胞表面表達和分泌表達系統(tǒng)，其試驗結(jié)果表明，VP2 蛋白和LTB 共表達時，可增強黏膜免疫反應，其中LTB 具有較好的免疫原性、抗原性和佐劑特性，這一研究為研制新型、有效的豬細小病毒口服疫苗奠定了基礎[11]。

3.5 口蹄疫

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）引起的一種烈性、急性動物傳染病，其臨床癥狀表現(xiàn)為口腔黏膜、蹄部及乳房皮膚發(fā)生水皰和糜爛，具有很快的傳播速度，并且影響范圍較大，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來非常大的經(jīng)濟損失[12]。隨著畜牧業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模化程度的提高，口蹄疫對畜牧養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越大，其預防難度不斷增大，傳統(tǒng)預防措施已明顯不足，這對新的防控技術，尤其是對安全有效的新型疫苗的需求日漸迫切。李云崗等構(gòu)建FMDV VP1 乳酸桿菌口服疫苗，并用其免疫仔豬，檢測結(jié)果顯示，這一疫苗能產(chǎn)生比較高的抗體效價，能誘導體液免疫和細胞免疫[13]。王淼等構(gòu)建的重組乳酸桿菌免疫豚鼠的結(jié)果也顯示，乳酸菌口服疫苗可以增強動物的免疫功能，預防FMDV 的感染[14]。

3.6 豬鏈球菌病

豬鏈球菌（Streptococcus suis）根據(jù)菌體莢膜抗原特性的差別，可以分為35個血清型，其中豬鏈球菌2 型感染時，致病性較強，傳播速度較快，并且其致死率較高[15]。豬鏈球菌病流行沒有明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，因此，為控制豬鏈球菌病的發(fā)生應以預防為主。張秋香等將豬鏈球菌毒力因子EF和MRP 基因連接在組成型啟動子P59 和信號肽Usp45 下游，構(gòu)建乳酸菌表達載體，使其在干酪乳桿菌中表達，制備口服疫苗[16]。用這種口服疫苗飼喂小鼠發(fā)現(xiàn)，這種重組乳桿菌可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體，這一研究為豬鏈球菌病乳酸菌口服疫苗的研制提供了實驗基礎。

4 乳酸菌口服疫苗的問題與展望

首先，乳酸菌作為口服疫苗載體雖然具有很多優(yōu)點，但在乳酸菌疫苗市場化之前仍面臨很多問題。目前可用于構(gòu)建疫苗的載體菌株僅限于乳酸乳球菌和乳酸桿菌屬中的幾個菌株，表達的抗原蛋白僅限于幾種，構(gòu)建成功的疫苗也不多，開發(fā)更多、更有效的疫苗載體株，構(gòu)建更多、更有效的疫苗是今后的一個研究方向。第二，對目前構(gòu)建的疫苗效果的研究僅限于動物試驗階段和體外試驗階段，疫苗的臨床應用還需一段時間。第三，口服免疫是益生菌疫苗的一個重要優(yōu)勢，這要求疫苗菌株要能經(jīng)受人體胃腸道胃酸和膽鹽的作用。而且，工程菌在體內(nèi)可以存活多久及乳酸桿菌攜帶抗原表達的效果有待確定。另外，動物及人體腸道的微生態(tài)系統(tǒng)非常復雜，疫苗菌株與其他微生物間是否相互影響，這種影響是否會削弱疫苗的免疫效果是疫苗臨床應用中應考慮的問題。