副雞禽桿菌感染PCR診斷及臨床藥物防治比較試驗

文正常 王璇 吳玙彤 吳仙 潘淑惠* 胡偉

（1，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 550005；2，貴州苗疆生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司 556300）

副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）感染在養(yǎng)雞生產(chǎn)中俗稱雞傳染性鼻炎，主要以甩鼻、鼻竇急性炎性腫脹、急性敗血性死亡為主要臨床表現(xiàn)。近年來，該病在蛋雞及肉雞群中發(fā)生頻率不斷增高，已逐步成為貴州地區(qū)危害養(yǎng)雞生產(chǎn)的一種主要常發(fā)性疫病。發(fā)病初期，由于特異性臨床癥狀不顯著，極易誤診為慢性呼吸道疾病，因用藥誤差導(dǎo)致病程延誤，發(fā)病雞群產(chǎn)蛋率急劇下降和急性死亡，給養(yǎng)雞場帶來較大經(jīng)濟損失。由于近年來養(yǎng)雞生產(chǎn)上抗生素、磺胺類藥物的不規(guī)范使用，其耐藥性較為明顯，如處置方法不當，致使該病在短期內(nèi)難以得到有效控制且極易復(fù)發(fā)。同時，因藥物對致病菌的抑制作用往往給病原分離鑒定帶來一定困難。為此，近年來，我們將PCR 擴增技術(shù)用于副雞禽桿菌感染的診斷，提高了診斷的準確性，給處置方案的制定和疾病控制贏得時間。同時，根據(jù)其臨床病理特性先后用不同藥物處置方案對其防治效果進行評估，篩選出最佳優(yōu)化防治技術(shù)方案，在及時有效控制疫病的同時，也有利于雞群在短期內(nèi)生產(chǎn)（生長）性能的恢復(fù)?，F(xiàn)將其診斷及藥物防治臨床試驗情況給予報道，供同業(yè)者借鑒。

1 發(fā)病情況及臨床病理特性

蛋雞多發(fā)生于50～85日齡育成階段和產(chǎn)蛋高峰期，肉雞常見于中大雞且季節(jié)性氣溫多變時高發(fā)。發(fā)病早期多呈現(xiàn)“甩鼻”為主的慢性呼吸道癥狀，個別患雞鼻孔周邊有漿液性滲出，少量凝固呈棕褐色，很難與雞毒支原體引起的雞慢性呼吸道病進行臨床鑒別；隨著發(fā)病時間的延長（4～5d），部分患病雞鼻竇部呈現(xiàn)急性炎性腫脹（圖 1、圖2），晚間呼吸啰音明顯，采食量逐步下降；蛋雞產(chǎn)蛋量下降明顯，畸形蛋顯著增多，雞群呈現(xiàn)急性死亡，雞冠和鼻竇眶周邊組織發(fā)紺，重者口腔內(nèi)有大量灰乳色膿性分泌物滲出；剖檢鼻竇腔內(nèi)見大量灰白色豆渣樣炎性分泌物沉積（圖3），部分從咽喉到口腔部充滿大量灰白色膿性分泌物（圖4）；發(fā)病中期肺組織呈炎性水腫、充血，腸道炎癥變化明顯，拉黃綠色混合稀便；肝、脾、腎等主要臟器無顯著炎性變化。

2 PCR診斷

2.1 試驗材料

2.1.1 試驗病料

試驗用心臟血液、心包液、鼻竇腔分泌物、鼻竇組織等主要病料采集至疑似患病雞只。

2.1.2 主要試驗試劑

胎牛血清購自浙江天抗生物科技有限公司；GoldView I 型核酸染色劑、Tris、EDTA 等購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白大豆瓊?cè)鉁⊿AB）、DL2000、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U Polymerase/μL）、TIANGEN 血液/細胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；苯酚、氯仿、無水乙醇等均為國產(chǎn)試劑。

圖1

圖2

圖3

2.2 試驗方法

2.2.1 細菌培養(yǎng)分離

采集患雞心臟血液、心包液、鼻竇腔分泌物、鼻竇組織，在無菌條件下接種于胰蛋白大豆瓊?cè)鉁囵B(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)24～36h，待細菌生長后再轉(zhuǎn)培養(yǎng)到胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)，選擇性挑取單個菌落再37℃單獨培養(yǎng)，經(jīng)PCR 擴增檢測，收集目標菌凍存。

2.2.2 PCR 引物

參照陳小玲的方法，將副雞禽桿菌保守片段引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，預(yù)期基因片段大小為500bp。

上游引物：5′～TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT～3′；

下游引物：5′～CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT～3′。

2.2.3 基因組提取

分別取分離菌株、眶下竇及鼻腔組織、鼻竇腔炎性分泌物參照TIANGEN 細菌/血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒說明書進行，提取的DNA 于-20℃保存。

2.2.4 PCR 擴增

PCR 反應(yīng)體系 25μL：2×Taq PCR MasterMix12.5μL，上、下游引物各 1μL，DNA 模板 2μL，用雙蒸水 補足至 25μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10min；95℃變性 45s，56℃退火30s，72℃延伸 1min，30個循環(huán)；72℃延伸 10min。PCR 產(chǎn)物于4℃保存。擴增產(chǎn)物的檢測：取6μL 擴增產(chǎn)物加入10g/L 瓊脂糖凝膠中電泳 25min 左右（電壓 90V，電流 40～60mA），然后在凝膠成像儀下觀察。

2.2.5 核苷酸序列測定與分析

將PCR 擴增產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司進行核苷酸序列測定。

3 不同藥物臨床防治比較試驗

從 2017～2018年，先后用“頭孢噻呋鈉粉”“10%磺胺間鉀氧粉”“孢噻呋鈉粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”“5%恩偌沙星粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”等藥物防治技術(shù)方案，按照5d 一個藥物治療流程，對48 批次47.1萬羽不同日齡段的發(fā)病雞群進行臨床應(yīng)用效果比較，對其治愈情況、復(fù)發(fā)性、死亡率、用藥成本、副反應(yīng)等指標進行統(tǒng)計分析，綜合評估其應(yīng)用效果，篩選出較為可靠、穩(wěn)定的臨床藥物防治方案。

4 試驗結(jié)果分析

4.1 PCR擴增

經(jīng)DNA 產(chǎn)物擴增顯示，細菌及組織樣本均為相近的目的基因擴增條帶，其片段大小均為500bp（圖5），與預(yù)期結(jié)果相符。

4.2 核苷酸序列分析

經(jīng)比對，PCR 擴增產(chǎn)物與GenBank 登錄副雞禽桿菌的基因序列重合率為99%，與預(yù)期目標一致（圖6），證明擴增片段為副雞禽桿菌基因片段。

4.3 不同藥物方案臨床防治應(yīng)用效果評價

附表中臨床藥物試驗統(tǒng)計共涉及48 批次、47.1 萬羽發(fā)病雞群，其結(jié)果顯示，“頭孢噻呋鈉粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”、“5%恩偌沙星粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”兩個藥物治療方案，均兼顧了副雞禽桿菌感染過程中生產(chǎn)雞群呼吸道炎癥及腸道疾病的繼發(fā)性感染或混合感染情況，其臨床治療效果及穩(wěn)定性等均優(yōu)于“頭孢噻呋鈉粉”和“10%磺胺間鉀氧粉”藥物治療方案，可在一個用藥周期（5d)內(nèi)快速、有效控制疫病，有利于雞群在短期內(nèi)生產(chǎn)（生長）性能的恢復(fù)。蛋雞的治療效果優(yōu)于肉雞，主要與蛋雞為舍飼籠養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，集中用藥時飲水充分，均勻度較好，受到外環(huán)境干擾因素相對肉雞較少。

圖5 PCR 擴增產(chǎn)物

圖6 基因序列比對結(jié)果

5 討論與小結(jié)

（1）在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，副雞禽桿菌感染在發(fā)病早期多以“甩鼻”為主要臨床表現(xiàn)，其臨床觀察診斷極易與雞毒支原體感染導(dǎo)致的雞“慢性呼吸道”病相混淆，早期誤診和用藥方案不當較為常見，因病程延長極易導(dǎo)致疾病快速爆發(fā)和患雞急性死亡。因此，在發(fā)病早期必須仔細觀察，當用治療雞“慢性呼吸道”的藥物2～3d 無效或雞群中部分患雞出現(xiàn)鼻孔炎性分泌物增加、鼻竇腫脹等特異性癥狀時，應(yīng)及時確診或調(diào)整用藥方案，避免不必要的經(jīng)濟損失。

（2）頭孢噻呋鈉粉和磺胺間鉀氧粉是養(yǎng)禽生產(chǎn)上的常用藥物，也是治療副雞禽桿菌感染的首選特異性藥物，當副雞禽桿菌感染雞群發(fā)病后，由于藥物使用對病原的抑制性，往往給病原分離鑒定帶來一定困難，因此，PCR 快速診斷技術(shù)方法的應(yīng)用能在較短時間內(nèi)實現(xiàn)副雞禽桿菌感染的特異性診斷，給治療藥物方案的制定和疾病控制贏得時間，降低了疾病給雞群帶來的經(jīng)濟損失，也有利用雞群生產(chǎn)（生長）性能的恢復(fù)。

附表 發(fā)病雞群臨床藥物治療情況統(tǒng)計表

（3）目前，副雞禽桿菌感染性疫病肉雞常見于中大雞且季節(jié)性氣溫驟變時多發(fā)，蛋雞多發(fā)生于青年雞轉(zhuǎn)群分籠或產(chǎn)蛋高峰期，表明生產(chǎn)（生長）應(yīng)激和季節(jié)性氣溫驟變是其發(fā)生的主要誘因。由于多數(shù)養(yǎng)雞農(nóng)戶或養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理經(jīng)營匱乏，只有當雞群發(fā)生大量死亡時才送檢，雞群已處于疫病發(fā)生的中后期，呼吸道、腸道繼發(fā)感染性疾病明顯，由于生產(chǎn)上頭孢噻呋鈉和磺胺間鉀氧藥物的長期或大劑量使用，形成了一定的耐藥性，在一定程度上限制了藥物作用的有效發(fā)揮。因此，在制定藥物治療方案時，要充分兼顧對繼發(fā)感染性疾病的控制。48 批次、47.1 萬羽的臨床試驗病案統(tǒng)計分析表明，“頭孢噻呋鈉粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”、“5%恩偌沙星粉+10%磺胺間鉀氧粉+50%卡巴匹啉鈣粉”兩個藥物治療方案，是目前能在一個用藥周期（5d) 內(nèi)快速、有效控制副雞禽桿菌感染的優(yōu)化方案，也有利于雞群在短期內(nèi)生產(chǎn)（生長）性能的恢復(fù)。同時，在副雞禽桿菌感染發(fā)病期，堅持用消毒劑每天帶群消毒，可有效減緩疫病在雞群中的擴散傳播。

（4）應(yīng)國家對禽蛋產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量安全及獸藥使用規(guī)范的要求，在制定藥物治療方案時，恩偌沙星禁止在蛋雞產(chǎn)蛋期使用，對95～135日齡的肉雞應(yīng)建立休藥期。