食品微生物污染檢測(cè)方法綜述

□ 阮雁春 江蘇旅游職業(yè)學(xué)院

1 前言

食品安全與衛(wèi)生問題是當(dāng)前食品領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)，其中包括新的食源性致病菌株、摻假食品、長期食用轉(zhuǎn)基因食品、食品中存在的化學(xué)污染物和食品腐敗等，而微生物污染是導(dǎo)致諸多食品安全問題的主要因素?？焖倬珳?zhǔn)的食品微生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)于保障安全的食物供應(yīng)和減少食源性疾病的發(fā)生率是十分重要的。常規(guī)方法來檢測(cè)食品中微生物比較耗時(shí)，且不能分析新的物種，因此許多食品分析需要采用快速檢測(cè)方法?？焖贆z測(cè)方法可分為：核酸序列技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、免疫學(xué)方法。這些快速檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、高效性與耗時(shí)少等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有很大的優(yōu)勢(shì)。本文就微生物檢測(cè)方式在食品中的應(yīng)用情況以及其各自所具備的特點(diǎn)進(jìn)行綜述。

2 生物檢測(cè)技術(shù)

2.1 依靠培養(yǎng)的微生物學(xué)方法

依賴于生物培養(yǎng)的方法需要長時(shí)間的收集樣品，在選擇性或合適的培養(yǎng)基上獲得可見的微生物菌落。大多數(shù)食源性和水源性病原體的潛伏期為18～24 h，微生物菌株不同潛伏時(shí)間也不同，最長可達(dá)72 h。該方法只能計(jì)數(shù)那些可在一定培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、選擇性培養(yǎng)基和氧氣條件下生長的微生物。生物發(fā)光是利用特定酶（如熒光素酶）在酶促反應(yīng)期間的發(fā)光能力，檢測(cè)微生物的常見方法，可用于檢測(cè)確定的細(xì)胞及其生理狀態(tài)。生物發(fā)光還可以用來測(cè)量活細(xì)胞中三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生，其可用作熒光素酶反應(yīng)中的底物。噬菌體分型專門用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌菌株并用于追蹤感染源，該方法在很長一段時(shí)間內(nèi)被用作檢測(cè)和鑒定生物的工具。但是，當(dāng)前只有少數(shù)基于噬菌體的方法從中試規(guī)模實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床診斷實(shí)驗(yàn)。研究表明，該方法對(duì)于腸道沙門氏菌和大腸桿菌的檢測(cè)具有高度特異性[1]。

2.2 基于核酸序列的檢測(cè)技術(shù)

基于免疫學(xué)和核酸序列的檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是微生物學(xué)中最有效的技術(shù)?；诤怂嵝蛄械姆椒ㄈ鏟CR技術(shù)，可以檢測(cè)微生物及其毒素，但免疫方法對(duì)于微生物的檢測(cè)并不依賴于其是否含有蛋白質(zhì)。這些技術(shù)包括：整合基因分析、多重PCR技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（或PCR—DGGE）與長度異質(zhì)性聚合酶鏈反應(yīng)（LH—PCR）。此外，還有數(shù)字實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT—PCR）等[2]。遺傳指紋技術(shù)基于PCR擴(kuò)增，與PCR克隆和測(cè)序方法相比，此技術(shù)更容易實(shí)現(xiàn)且耗時(shí)更短。指紋技術(shù)的基礎(chǔ)是通過在運(yùn)行凝膠（瓊脂糖或聚丙烯酰胺）上的電泳遷移差異確定擴(kuò)增的遺傳序列的多樣性。

3 生物傳感器

生物傳感器是一種化學(xué)傳感裝置，其能夠?qū)⑷魏紊?、生物衍生材料、仿生材料與物理化學(xué)檢測(cè)器或換能器結(jié)合。生物傳感器根據(jù)其轉(zhuǎn)導(dǎo)方案不同，可以分為不同類型，并應(yīng)用于不同領(lǐng)域（如臨床和食品檢測(cè)、生物防御、水安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等）[3]。據(jù)最新資料顯示，由于微生物污染和腐敗所造成的食物浪費(fèi)占全球食品總消費(fèi)量的1/3以上[4]。高效快速的生物傳感檢測(cè)技術(shù)，可以從源頭檢測(cè)控制食品中微生物情況，有效減少整個(gè)食物損失。

3.1 電化學(xué)生物傳感器

這種生物傳感器主要是通過檢測(cè)樣品與傳感器在基質(zhì)界面上的相互作用所導(dǎo)致的電流、電勢(shì)等參數(shù)的變化情況，進(jìn)而得到分析結(jié)果。在各種類型的生物傳感器系統(tǒng)中，電流分析法是最常用和最常用的電化學(xué)方法。相對(duì)而言，電位分析法不太常見，其通常由生物活性物質(zhì)和離子選擇性膜組成，在反應(yīng)過程中產(chǎn)生極小的濃度變化?；谔技{米管和石墨烯的電位生物傳感器，可快速和超靈敏檢測(cè)真實(shí)體系樣品中的微生物。結(jié)合了微加工和納米加工的阻抗法，是較為新型的生物傳感器，并被寄予厚望[5]。

3.2 光學(xué)傳感器

光學(xué)傳感器具有高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，可快速檢測(cè)病原菌、各種毒素和污染物。目前，生物傳感器已納入納米生物技術(shù)，在臨床和即時(shí)檢測(cè)（POC）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另一個(gè)應(yīng)用是納米孔技術(shù)，光學(xué)生物傳感器和微流體技術(shù)的組合，當(dāng)與特定細(xì)菌抗體比對(duì)時(shí)，它們可以基于納米孔陣列上的阻斷效應(yīng)檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，導(dǎo)致孔隙可用性降低。等離子體生物傳感器是最具吸引力的光學(xué)生物傳感器，主要的等離子體生物傳感器系統(tǒng)使用的是表面等離子共振（SPR）和表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS），但前一種技術(shù)的靈敏度相對(duì)較低。

4 生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

4.1 生化表征

當(dāng)前較為常見的檢測(cè)微生物方法有各類常規(guī)觀察法以及生物化學(xué)方法。比如形態(tài)學(xué)檢查，微生物菌落能夠向經(jīng)驗(yàn)豐富的微生物學(xué)家提供鑒定線索。根據(jù)細(xì)胞壁構(gòu)造和組成差異，微生物可分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌；其他化學(xué)特性也在細(xì)菌鑒定中起重要作用，例如糖發(fā)酵、酶和抗生素抗性，這些都可以很容易檢測(cè)。有幾種生化測(cè)試可以幫助細(xì)菌鑒定，例如，表征纖維素酶活性、過氧化氫酶活性、反硝化試驗(yàn)、硫化氫的產(chǎn)生和細(xì)菌樣品的碳源利用情況等。如今，更便捷強(qiáng)大的基于核酸序列的技術(shù)等較上述方法，更加有優(yōu)勢(shì)。

4.2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)方法是基于抗體和抗原的特異性結(jié)合的原理進(jìn)行檢測(cè)，食品研究中廣泛使用的免疫學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、酶聯(lián)熒光試驗(yàn)（ELFA）以及免疫磁分離（IMS），其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)結(jié)合顏色變化進(jìn)行鑒定，是最通用的免疫測(cè)定方法，當(dāng)前已有市售的ELISA試劑盒[6]。酶聯(lián)熒光試驗(yàn)也是一種基于免疫學(xué)的方法，但更靈敏。免疫磁分離是一種實(shí)驗(yàn)室工具，可以有效地從各種體液和原代培養(yǎng)細(xì)胞中分離細(xì)胞，它可以用來量化食物、血液或者糞便等樣本的致病性。

5 微生物儀器檢測(cè)技術(shù)

微生物檢測(cè)儀器的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本的及時(shí)檢測(cè)和評(píng)估。在二十世紀(jì)九十年代以前，人們常通過計(jì)數(shù)和生化分析進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，而顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、光學(xué)方法、生物發(fā)光、超聲波和量熱法在二十世紀(jì)九十年代開始用于檢測(cè)，另有物理化學(xué)方法也可以用于檢測(cè)微生物。例如，用于脂肪酸分析和微生物檢測(cè)的氣相色譜法，當(dāng)前仍用于檢測(cè)各種微生物化合物，基于紅外光譜的其他儀器技術(shù)也普遍被應(yīng)用在該領(lǐng)域。

5.1 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀是生物領(lǐng)域一種十分主要的檢測(cè)工具，也是傳統(tǒng)激光技術(shù)的改進(jìn)技術(shù)。它由幾個(gè)主要部件：激光器、樣品室和裝有光電倍增管的光電探測(cè)器系統(tǒng)組成。由于其簡(jiǎn)單快速的性能，流式細(xì)胞儀常被用作臨床檢測(cè)中的殺菌活性檢測(cè)。研究表明，流式細(xì)胞儀可以在食品工業(yè)中檢測(cè)微生物的污染情況，提供關(guān)于微生物生理狀態(tài)的詳細(xì)知識(shí)，同時(shí)通過使用特異性探針和熒光染料，可以在混合培養(yǎng)物中快速計(jì)數(shù)。

5.2 氣相色譜和質(zhì)譜

其在分析化學(xué)中常見的應(yīng)用是分析揮發(fā)性化合物，通常用于純度測(cè)試以及鑒定混合物中的物質(zhì)。此外，還可以通過色譜分離純物質(zhì)。該技術(shù)近年來被發(fā)現(xiàn)可用于鑒定微生物。氣相色譜—質(zhì)譜（GC—MS）是鑒定和檢測(cè)細(xì)菌及其化合物的有效工具。新的小型化技術(shù)如GC—DMS（氣相色譜—差示遷移譜）已用于檢測(cè)大腸桿菌等，同時(shí)通過GC—MS進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果。這兩種技術(shù)都可以用于檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞釋放的各種化合物（如O—硝基苯酚和吲哚）?；|(zhì)輔助激光解吸電離—飛行時(shí)間（MALDI—TOF）質(zhì)譜，提供了特定的生物標(biāo)志物配置文件，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，高效且成本較低。MALDI—TOF MS已被用于快速檢測(cè)高致病性細(xì)菌，包括芽孢桿菌、耶爾森氏菌、伯克霍爾德氏菌、弗朗西斯菌和布魯氏菌等[7]。

6 光譜技術(shù)

光譜學(xué)涵蓋了物質(zhì)和電磁輻射之間的所有相互作用。紅外光譜是微生物識(shí)別系統(tǒng)中最廣泛的一種方法。它分為近紅外（NIR）、中紅外（MIR）和遠(yuǎn)紅外（FIR）光譜3個(gè)主要區(qū)域，并且具有比可見光譜更長的波長。該技術(shù)通常應(yīng)用于有機(jī)和無機(jī)分析化學(xué)中，以確定分子的各種官能團(tuán)。最具發(fā)展?jié)摿Φ墓庾V技術(shù)包括傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、拉曼光譜和高光譜成像，其已被用于快速檢測(cè)微生物污染[8]。

7 展望

致病微生物在食品中的危害是當(dāng)前食品領(lǐng)域的一個(gè)重要挑戰(zhàn)，也是造成經(jīng)濟(jì)損失的主要禍?zhǔn)?。本著“預(yù)防勝于治療”的原則，實(shí)現(xiàn)食品中致病和致腐微生物的快速高效檢測(cè)，是降低微生物危害的有效手段，因此，當(dāng)前迫切需要開發(fā)智能、快速和可靠的微生物檢測(cè)方法，尤其是在線檢測(cè)方法。隨著技術(shù)不斷的發(fā)展進(jìn)步，很多限制因素會(huì)慢慢得到解決。