牡蠣酶解工藝及其藥理活性研究進展

□ 蔡樹杏 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院

王錦旭 韓山師范學院食品工程與生物科技學院 中國水產科學研究院南海水產研究所農業(yè)農村部水產品加工重點實驗室

1 前言

牡蠣俗稱蠔或海蠣子，因肉質鮮美可口而受到人們的喜愛，具有很高的藥用價值，并且含有豐富的蛋白質和碳水化合物，因其鋅含量極高，富含鐵、鈣等元素。根據(jù)相關研究報道，牡蠣多糖、多肽具有較高的生物活性，牡蠣多糖、多肽的提取方法有堿提取法、酸提取法、蛋白酶水解法等。堿提取法和酸提取法的條件較為劇烈，且無選擇性，所以近年來酶提取工藝得到較好發(fā)展。由單一酶解法，到多種酶復合酶解，再到多種酶分步酶解、酸酶結合酶解、多糖多肽聯(lián)產加工，其目的都是得到不同分子量的不同生物活性成分，或者降低生產成本，總之，酶解技術的發(fā)展為研究牡蠣活性成分、活性作用提供了一種高效的途徑。

2 酶解工藝

研究牡蠣酶解技術，一是為了獲得營養(yǎng)更加豐富、味道更加鮮美的調味品。二是為了尋找具有生物活性作用的多糖或者多肽。酶解工藝條件包括酶的種類，添加的數(shù)量、順序，酶解時間等，不同的酶解技術得到的酶解產物不同，分子量和結構都存在差異，酶解的程度也不一樣，所得產物的風味和活性作用也存在差異。從酶解技術的發(fā)展來說，復合酶解、多步酶解可以得到酶解程度更高、目標分子量更為精準、活性更高的產物。

2.1 單一酶酶解

王長偉[1]等以新鮮無殼牡蠣為原料，采用胰酶酶解的方法制備牡蠣活性肽，經膜分離后得到均分子量為750 Da的活性肽。趙榮濤[2]等利用化學方法分別評價9種酶對牡蠣蛋白酶解多肽的降血糖和抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)經風味蛋白酶酶解得到的多肽抗血糖升高作用較強，糜蛋白酶酶解得到的多肽抗氧化作用較強。張雪妍[3]等利用木瓜蛋白酶對牡蠣進行酶解，得到質量濃度為14.95 mg/mL的酶解液。徐慧[4]等利用納豆芽孢桿菌對牡蠣邊角料進行酶解，發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌可以用于牡蠣的發(fā)酵。許慶陵[5]等利用Alcalase堿性蛋白酶水解牡蠣，制備牡蠣水解蛋白，得到水解度為40.38%的牡蠣多肽。馮丹丹[6]等研究了4種蛋白酶對牡蠣的酶解作用，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌中性蛋白酶的水解程度最高，其次為風味蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的水解程度較低。

2.2 復合酶酶解

劉海梅[7]等采用Protemax復合蛋白酶水解牡蠣肉，得到水解度為27.28%的牡蠣多肽。姚玉靜[8]等選用胰蛋白酶和風味蛋白酶深度酶解牡蠣，發(fā)現(xiàn)牡蠣深度酶解的最優(yōu)工藝條件為胰蛋白酶與風味蛋白酶的質量比為2∶1，該條件下得到的牡蠣深度酶解產物中分子量小于3 ku的多肽達到83.5%。張典[9]等采用胰蛋白酶和風味蛋白酶協(xié)同酶解牡蠣，得到的蛋白質水解度和蛋白回收率分別為37.82%和71.87%。李園[10]等用無花果蛋白酶和風味蛋白酶水解牡蠣肉制備抗氧化酶解液，發(fā)現(xiàn)無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為5∶1（質量比）時，該酶解液具有較高的抗氧化活性和蛋白質回收率。

2.3 多種酶分步酶解

邱娟[11]等利用復合蛋白酶和堿性蛋白酶分步酶解牡蠣，制備得到純度為99.72%分子質量小于3 000 Da的具有ACE抑制作用的活性肽。胡雪瓊[12]等比較了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶不同組合的酶解效果，發(fā)現(xiàn)先用枯草桿菌中性蛋白酶，再加胰蛋白酶對牡蠣進行程序酶解，可得到牡蠣糖胺聚糖含量為2.40%的粗提物。方富永[13]等利用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶3種酶依次對牡蠣進行酶解，得到相對分子質量（Mr）在300～1 000的多肽。

2.4 酸酶結合水解

因為單純酶解成本太高，酸水解成本低但無選擇性，為了酶解徹底，且節(jié)約成本，楊留明[14]等利用酸酶結合法水解牡蠣肽，即先用醋酸酸解，選擇胰蛋白酶與風味蛋白酶（質量比為2∶1）酶解，得到水解度為36.25%±0.63%的牡蠣肽。

2.5 多糖多肽聯(lián)產加工技術

為了綜合開發(fā)利用牡蠣多糖、多肽，楊大俏[15]等利用Alcalase酶、胰蛋白酶結合膜過濾，同時提取、分離牡蠣多糖和多肽，實現(xiàn)了牡蠣多糖及多肽的聯(lián)產技術。

3 酶解產物的活性作用

3.1 免疫調節(jié)作用

許丹[16]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可改善CTX所致免疫低下小鼠免疫器官結構紊亂，恢復CTX造成的小鼠T淋巴細胞比例失調及細胞因子紊亂，升高骨髓有核細胞數(shù)及骨髓DNA含量，從而增強機體免疫功能。李婉[17]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解產物可提高脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞的免疫功能，且小于2.5 kDa組分和2.5～5 kDa組分的免疫功能優(yōu)于其他組分。胡雪瓊[18]等采用小鼠體內注射環(huán)磷酰胺（CTX）法建立免疫抑制動物模型，牡蠣糖胺聚糖對正常小鼠免疫器官指數(shù)、抗體生成數(shù)和血清溶血素、細胞免疫、單核巨噬細胞、NK細胞殺傷活性的均有顯著影響,表明其具有免疫增強功能。陳曉文[19]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肽可以增加免疫器官的相對重量和血清溶血素含量，并能顯著增加抗體生成細胞和遲發(fā)型變態(tài)反應。劉淑集[20]等研究認為牡蠣寡肽能夠顯著提高脾淋巴細胞的增殖能力、NK細胞活性、廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)a、吞噬中性紅能力、TNF－α、IL－6、溶血素水平和改善脾淋巴細胞CD3+4T淋巴細胞亞群及CD3+8T淋巴細胞亞群分布（P＜0.05），而對小鼠的肝、脾臟指數(shù)影響不顯著。

3.2 抗病毒作用

李江濱[21]等采用血凝滴度測定牡蠣多糖對流感病毒在狗腎細胞（MDCK）中增殖的抑制作用，結果表明牡蠣多糖能顯著降低和抑制狗腎細胞培養(yǎng)流感病毒的血凝滴度。李萌[22—23]等研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣糖胺聚糖（O—GAG）能顯著降低Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV—1）感染小鼠的死亡率，延長其存活時間，并明顯提高病毒感染小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，增強巨噬細胞吞噬能力，從而對感染Ⅰ型單純皰疹病毒的小鼠具有一定的治療作用，并能提高小鼠的免疫功能。

3.3 降血糖、血壓

王海桃[24]等研究了牡蠣提取物牡蠣糖胺聚糖對過氧化氫誘導的血管內皮細胞氧化損傷模型的影響發(fā)現(xiàn)，牡蠣糖胺聚糖對過氧化氫誘導的血管內皮細胞氧化損傷有保護作用，能有效防止因血管內皮損傷而引起的高血壓、動脈硬化、腦卒中等多種心血管疾病。邱娟[11]等研究發(fā)現(xiàn)分子質量在3 000Da以下的牡蠣肽具有ACE抑制活性，其IC50為0.8 mg/mL，因此，牡蠣多肽具有降血壓作用。歐成坤[25]等研究認為牡蠣經酸性蛋白酶酶解得到的產物在ACE抑制活性、清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH·自由基方面均優(yōu)于或近似于Aclalase堿性蛋白酶酶解產物。趙榮濤[2]研究發(fā)現(xiàn)風味蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽對α—淀粉酶的抑制效果最好，多肽濃度為5 mg/mL時抑制率達到67.13%，IC50值為3.806 mg/mL。

3.4 抗癌作用

李鵬[26]等用牡蠣活性肽，對人胃癌BGC—823細胞凋亡的生物學效應及其對胃癌細胞的作用做了研究。結果顯示，牡蠣活性肽能有效抑制胃癌BGC—823細胞的增殖活動，出現(xiàn)亞G1期細胞，細胞進入凋亡狀態(tài)，表明其具有顯著的誘導凋亡作用。胡雪瓊[12]等采用四氮唑藍還原法（MTT法）研究牡蠣糖胺聚糖對人宮頸癌細胞（Hela細胞）的體外抗腫瘤活性，結果顯示500 μg/mL 劑 量 組 與 600 μg/mL 劑量組48 h時的抑制率分別為43.1%（P＜0.05），55.8%（P＜0.05），因此近江牡蠣糖胺聚糖具有較明顯的抗腫瘤活性。

3.5 抗氧化

趙榮濤[2]等研究院發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽對超氧陰離子的抑制率最高，2 mg/mL時抑制率為53.64%，IC50值為1.75 mg/mL。魏穎[27]等研究認為牡蠣肽主要含有相對分子量低于1 000 U的八肽以下的短肽，該短肽具有抑制細胞內ROS生成的能力，并對ConA誘導的T—淋巴細胞增殖有抑制作用。李茹[28]等研究發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽具有最強的DPPH·自由基清除能力，其濃度為1 mg/mL時清除率最大。

3.6 抗衰老

李大煒[29]以不同劑量的牡蠣肽給大鼠灌胃4周，觀察各組間睪丸組織形態(tài)、生化指標及精子質量等差異，發(fā)現(xiàn)牡蠣肽能修復D—半乳糖致衰老大鼠睪丸組織的衰老形態(tài)；提高精子質量、干細胞因子濃度。張雪妍[3]等研究認為木瓜蛋白酶酶解得到的牡蠣多肽＜5 ku和5～10 ku超濾組分細胞增殖活性及促進睪酮分泌的活性均最強。