線粒體自噬的調(diào)控分子在不同病生理過(guò)程中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

陳紅光，謝克亮，于泳浩

細(xì)胞自噬是一種自我降解的過(guò)程，對(duì)平衡能量來(lái)源和應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)壓力是非常重要的。自噬通過(guò)再利用或降解錯(cuò)誤折疊或聚集蛋白、清除受損細(xì)胞器以及細(xì)胞內(nèi)病原體等對(duì)細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)起到了重要的作用[1]，因此，自噬通常被認(rèn)為是一種生存機(jī)制，盡管自噬在非選擇性的或選擇性清除特定細(xì)胞器，核糖體和蛋白質(zhì)聚集體等方面的機(jī)制尚未完全解決。除了消除細(xì)胞內(nèi)聚集體和受損細(xì)胞器之外，自噬還促進(jìn)細(xì)胞衰老和細(xì)胞表面抗原呈遞，防止基因組不穩(wěn)定并防止壞死，同時(shí)也在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。而線粒體自噬是一種選擇性自噬，通過(guò)清除受損和/或功能異常的線粒體，對(duì)線粒體的進(jìn)行質(zhì)量控制，維持線粒體網(wǎng)絡(luò)的正常功能，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的能量供應(yīng)[3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬在紅血球分化、神經(jīng)退行性病變、炎癥和凋亡、缺血再灌注損傷和代謝相關(guān)疾病等多種生命過(guò)程中起到了一定的作用[4]。本文就線粒體自噬的研究進(jìn)展做一個(gè)簡(jiǎn)要的介紹。

1 線粒體自噬

“自噬（autophagy）”一詞源于希臘語(yǔ)意思是“自己吃自己（eating of self）”，最初是由Christian de Duve在40年前提出的，主要基于用胰高血糖素灌注的大鼠肝臟時(shí)，觀察到線粒體和其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)在溶酶體內(nèi)降解[5]，在當(dāng)時(shí)人們并不理解這種現(xiàn)象，近年來(lái)，由于對(duì)我們對(duì)各種分子的理解以及對(duì)來(lái)自眾多實(shí)驗(yàn)室的這一過(guò)程的生理意義的重視，科學(xué)界重新認(rèn)識(shí)了自噬，并且通過(guò)分子生物學(xué)在酵母中描述了自噬是如何被調(diào)節(jié)和執(zhí)行的具體機(jī)制。自噬始于一種隔離膜結(jié)構(gòu)，也稱為吞噬泡，可能來(lái)源于由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體和內(nèi)涵體所形成的雙層脂質(zhì)膜，這種吞噬泡擴(kuò)展吞噬細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)聚集體，細(xì)胞器和核糖體，從而將要清除隔離在雙層膜自噬體中，自噬體通過(guò)與溶酶體融合而成熟，促使溶酶體酸性蛋白酶降解自噬體內(nèi)容物。溶酶體通透酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將氨基酸和其他降解副產(chǎn)物輸出回細(xì)胞質(zhì)，重新用于構(gòu)建大分子和新陳代謝。因此，自噬可以被認(rèn)為是一種細(xì)胞“回收工廠”，它通過(guò)ATP產(chǎn)生促進(jìn)能量效率，并通過(guò)清除非功能性蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)定[2]。而對(duì)于選擇性自噬了解最多的是線粒體自噬，其介導(dǎo)選擇性清除受損線粒體。通過(guò)早期電子顯微鏡研究首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觀察到線粒體自噬，其在用胰高血糖素刺激肝細(xì)胞分解代謝后在溶酶體中鑒定增加的線粒體。Lemasters和他的同事[6]利用這個(gè)模型以及饑餓和光損傷引起的自噬，首次使用線粒體自噬這個(gè)術(shù)語(yǔ)來(lái)描述線粒體吞噬到被自噬體標(biāo)記MAP1輕鏈3（LC3；酵母Atg8的同源物）包被的囊泡中，這一過(guò)程發(fā)生極快，可能在5分鐘內(nèi)發(fā)生。LC3（和Atg8）是一種泛素樣蛋白質(zhì)，在自噬體生物合成過(guò)程中與磷脂酰乙醇胺共價(jià)連接，從而使其能夠整合到自噬囊泡膜并參與貨物招募。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑培養(yǎng)以防止細(xì)胞溶解的神經(jīng)元中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)后通過(guò)線粒體自噬完全去除線粒體[7]。由于線粒體外膜透化發(fā)生在細(xì)胞凋亡期間胱天蛋白酶活化的上游，這些結(jié)果表明線粒體損傷可誘導(dǎo)線粒體自噬。這些早期研究表明，線粒體自噬調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量以符合代謝需求，也可能是一種去除受損線粒體的質(zhì)量控制形式[8]。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體自噬先于線粒體分裂[9]，將細(xì)長(zhǎng)的線粒體分割成可管理的大小以進(jìn)行包封，并通過(guò)線粒體自噬選擇性清除受損線粒體以進(jìn)行質(zhì)量控制， 除了質(zhì)量控制之外，線粒體自噬已被證明是穩(wěn)定狀態(tài)線粒體更新所必需的[10]，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量以改變代謝需要[11]。

2 線粒體自噬的重要調(diào)控分子

在哺乳動(dòng)物線粒體自噬過(guò)程中中，有多種不同的線粒體自噬效應(yīng)分子，包括線粒體自噬受體NIX/BNIP3和FUDNC1以及PINK1/Parkin途徑，這三種通路已被確定參與線粒體的選擇性清除。 自噬受體的一個(gè)共同特征是它們具有與LC3相互作用的LC3結(jié)合位點(diǎn)，從而促進(jìn)線粒體被包裹進(jìn)入到自噬囊泡中，從而發(fā)生線粒體自噬。

2.1 PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬 PINK1和Parkin突變已被認(rèn)為是隱性家族性帕金森病的最常見(jiàn)原因[12]。PINK1是一種核編碼的線粒體絲氨酸/蘇氨酸激酶[13]，Parkin是一種胞質(zhì)E3泛素化連接酶[14]。遺傳研究表明，PINK1和Parkin在同一途徑中起作用，并且PINK1在Parkin上游起作用[15]。過(guò)去幾年的大量工作極大地促進(jìn)了PINK1和Parkin協(xié)同作用介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體自噬的分子機(jī)制。

PINK1作為線粒體應(yīng)激感應(yīng)器，其作用依賴于線粒體膜電位。在健康線粒體中，PINK1被導(dǎo)入線粒體，然后在線粒體內(nèi)膜迅速發(fā)生降解。然而，當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，PINK1穩(wěn)定結(jié)合于外線粒體膜，募集Parkin至受損線粒體，啟動(dòng)線粒體自噬[15]。最近，有關(guān)PINK1-Parkin相互作用和Parkin激活的更多細(xì)節(jié)已經(jīng)被揭示。發(fā)現(xiàn)PINK1在線粒體去極化后激活并在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，包括Thr257，其使得PINK1在Ser65上磷酸化Parkin并導(dǎo)致Parkin的E3連接酶活性的激活[16]。據(jù)研究推測(cè)，在Parkin招募到線粒體并隨后被激活后，它泛素化不同的線粒體外膜蛋白，這可能通過(guò)與接頭蛋白（如p62和NRB1）相互作用介導(dǎo)線粒體隨后隔離到自噬囊泡中。迄今為止，研究人員已經(jīng)確定了Parkin的一些潛在底物，如mitofusins（Mfn1/2）[17]，Drp1[18]和PARIS（ZNF746）[19]，這些更加證明了Parkin在線粒體動(dòng)力學(xué)，線粒體運(yùn)輸和調(diào)控線粒體生物發(fā)生等方面發(fā)揮了廣泛作用。此外，研究表明p62是與Parkin一起募集至受損線粒體的[20]，通過(guò)其UBA（泛素化結(jié)合位點(diǎn)）和LIR（LC3結(jié)合序列）結(jié)構(gòu)域?qū)⑹軗p線粒體與自噬囊泡結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移至自噬溶酶體進(jìn)行降解。

2.2 NIX/BINP3通路 BCL2和腺病毒E1B 19-kDa-相互作用蛋白3（BNIP3）和BNIP3樣（BNIP3L，也稱為NIX）線粒體定位蛋白，其與BH3-only家族有關(guān)。除了它們?cè)诩?xì)胞凋亡中的作用之外，發(fā)現(xiàn)BNIP3和NIX通過(guò)其LIR序列與LC3家族蛋白相互作用，從而介導(dǎo)線粒體的清除[21-22]。使用NIX敲除型小鼠的研究顯示NIX參與網(wǎng)織細(xì)胞成熟過(guò)程[23]。線粒體的Nix依賴性清除與凋亡途徑不同，因?yàn)樗恍枰渌鸅cl2蛋白，如Bak，Bax，Bcl-xl，Bim或Puma[23]。那么Nix是如何參與線粒體自噬？ 關(guān)于網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟的研究表明，在誘導(dǎo)階段不需要Nix， 相反，在晚期Nix需要將線粒體攜帶進(jìn)入到自噬小體中，Nix含有稱為L(zhǎng)IR（LC3-相互作用區(qū)域）的保守LC3結(jié)合序列，因此可以將線粒體靶向輸送至自噬小體[24]。Nix的功能可能不限于紅細(xì)胞成熟，Nix也可能參與去極化誘導(dǎo)的線粒體自噬，因?yàn)镃CCP處理HeLa細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞中的Nix和LC3相互作用[21]，與Nix在紅細(xì)胞成熟過(guò)程中作用不同的是，用解偶聯(lián)劑FCCP處理網(wǎng)織紅細(xì)胞可以在Nix不存在的情況下的誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[25]，因此，我們Nix在去極化誘導(dǎo)的線粒體自噬中至多可能是具有促進(jìn)作用但并非是完全依賴性的。 Nix和另一種BH3-only蛋白質(zhì)Bnip3也參與缺氧誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞[24]和缺血再灌注的小鼠大腦神經(jīng)元細(xì)胞[26]的線粒體自噬。在缺氧期間清除線粒體對(duì)于減少ROS產(chǎn)生和維持氧穩(wěn)態(tài)是重要的。低氧條件下低氧誘導(dǎo)因子的激活誘導(dǎo)Nix和Bnip3的表達(dá)，其在高水平表達(dá)時(shí)可以破壞Bcl2和Beclin1之間的相互作用。而B(niǎo)eclin 1一旦釋放，可誘導(dǎo)ATG5依賴性自噬的發(fā)生[27]?，F(xiàn)在認(rèn)為，NIX/ BNIP3的上調(diào)可能是促進(jìn)它們?cè)诰€粒體自噬中的活性的關(guān)鍵事件，但是其具體的作用機(jī)制還未明確[23]。

2.3 FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬 最近，科研工作者已將FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1（FUNDC1）鑒定為一種新的線粒體自噬受體[28]。FUNDC1是一種外線粒體膜蛋白，含有三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其N端和C端分別暴露于胞質(zhì)溶膠和膜間隙[28]。 在FUNDC1沉默的細(xì)胞中，與對(duì)照細(xì)胞相比，缺氧處理不能誘導(dǎo)線粒體自噬，并且通過(guò)重新表達(dá)野生型FUNDC1可以挽救線粒體自噬[28]。 這些結(jié)果表明FUNDC1在缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬過(guò)程中作為特定的線粒體自噬受體起作用。研究發(fā)現(xiàn)FUNDC1在它的胞質(zhì)溶膠暴露的N-末端含有LIR序列，并且LIR基序?qū)τ贔UNDC1-LC3相互作用是必需的[28]。 FUNDC1的LIR突變顯著地使線粒體自噬受損，其LIR的缺失將阻斷線粒體自噬的誘導(dǎo)。 這些發(fā)現(xiàn)表明FUNDC1-LC3相互作用是FUNDC1誘導(dǎo)的線粒體自噬所必需的。

FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制最近已被揭示，研究發(fā)現(xiàn)FUNDC1的多位點(diǎn)磷酸化在調(diào)節(jié)FUNDC1-LC3相互作用中起關(guān)鍵作用[29]。在常氧環(huán)境下FUNDC1發(fā)生磷酸化。 Src和CK2分別是負(fù)責(zé)FUNDC1在Tyr18和Ser13處磷酸化的激酶，并且這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化可以抑制FUNDC1與LC3的相互作用。 在缺氧或線粒體解偶聯(lián)劑處理期間，Src和CK2失活，并且線粒體磷酸酶PGAM5與FUNDC1的Ser30相互作用發(fā)生去磷酸化，這種修飾增強(qiáng)了FUNDC1-LC3相互作用，從而誘導(dǎo)線粒體被自噬囊泡包裹發(fā)生線粒體自噬[28,30]。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除FUNDC1基因?qū)?huì)損害血小板中線粒體的質(zhì)量，并且增加線粒體的數(shù)量，使得血小板對(duì)缺氧刺激不敏感[31]。

3 線粒體自噬在疾病中的作用

在這一部分，我們將主要介紹線粒體自噬在不同病理過(guò)程中的作用。

3.1 線粒體自噬神經(jīng)退行性疾病的作用 帕金森病（PD）已經(jīng)被證實(shí)與線粒體功能障礙密切相關(guān)[32]，特別是PD患者的黑質(zhì)中復(fù)合體I活性降低和線粒體DNA的積累與PD的發(fā)生有特異性[33]。 PARK6和PARK2突變分別編碼PINK1和PARKIN蛋白，導(dǎo)致常染色體隱性PD，PD患者黑質(zhì)中中受損線粒體的清除缺陷可能是該疾病的重要病因。Sterky等人在Mito Park小鼠中使用線粒體熒光標(biāo)記（mito-YFP）研究了體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的線粒體動(dòng)力學(xué)。由于線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）的特異性敲除，Mito Park小鼠顯示PD特征，作者使用這些小鼠，發(fā)現(xiàn)呼吸鏈缺陷導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)碎片化，并形成來(lái)自線粒體的大細(xì)胞質(zhì)體。線粒體的順行軸突運(yùn)輸也在呼吸鏈缺陷的小鼠神經(jīng)元中受損，導(dǎo)致線粒體向軸突末端的供應(yīng)減少。有趣的是，Sterky等人發(fā)現(xiàn)功能失調(diào)的線粒體并未在體內(nèi)招募PARKIN，并且PARKIN的缺失也并未影響功能受損線粒體的清除和神經(jīng)退化表型[34]。這些數(shù)據(jù)表明線粒體功能障礙不足以招募PARKIN并誘導(dǎo)線粒體自噬。然而，最近的一項(xiàng)研究表明，在對(duì)局部損傷的反應(yīng)中，在遠(yuǎn)端軸突中出現(xiàn)了Parkin依賴的線粒體自噬[35]。近年來(lái)，許多研究討論了線粒體自噬和PARKIN介導(dǎo)的線粒體自噬在神經(jīng)退行性疾病如肌萎縮側(cè)索硬化[36]，亨廷頓病[37]和阿爾茨海默病[38]中的意義。比如，最近的研究結(jié)果表明線粒體自噬在唐氏綜合征（DS）中可能存在一定意義，唐氏綜合征患者的大腦表現(xiàn)出ROS平衡異常，并且ROS積聚增加，這表明線粒體受損[39]。但需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明線粒體自噬在這些疾病中的確切作用。

3.2 線粒體自噬在糖尿病中的作用 激素可以促進(jìn)或抑制線粒體的降解。例如，甲狀腺激素可以調(diào)控線粒體的代謝[40]，而禁食和胰高血糖素通過(guò)線粒體自噬和肝細(xì)胞中的非選擇性自噬促進(jìn)線粒體降解[41-42]。由于這些激素控制體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)，并在各種代謝紊亂中發(fā)揮重要作用，因此人們對(duì)線粒體自噬在肥胖癥，1型糖尿病和2型糖尿病中的作用越來(lái)越感興趣。先前已報(bào)道腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)型核蛋白1和2（TP53INP1和TP53INP2）是2型糖尿病的易感基因。這兩種蛋白質(zhì)含有LIR結(jié)構(gòu)域，因此可能在自噬中發(fā)揮作用[43]。缺乏TP53INP1的小鼠顯示易于發(fā)生氧化還原驅(qū)動(dòng)的肥胖和胰島素抵抗。TP53INP1-KO小鼠存在線粒體自噬缺陷，導(dǎo)致受損線粒體增加[44]。線粒體自噬缺陷導(dǎo)致氧耗率下降和線粒體ROS產(chǎn)生增加。并且TP53INP1也存在于線粒體中，與PINK1和PARKIN相互作用，但與NIX和BNIP3不相關(guān)[44]。像TP53INP1一樣，TP53INP2也可以調(diào)節(jié)自噬并且是自噬體形成和加工所必需的[45]，TP53INP2表達(dá)在來(lái)自2型糖尿病患者的肌肉組織和糖尿病小鼠模型中被抑制[46]。這種蛋白質(zhì)在線粒體自噬中的作用尚待確定。另外在基礎(chǔ)狀態(tài)下，胰腺β細(xì)胞功能需要自噬，ATG7敲除小鼠中自噬機(jī)制的遺傳失活導(dǎo)致葡萄糖刺激的胰島素分泌減少。同時(shí)在基礎(chǔ)狀態(tài)下敲除PINK1，對(duì)于胰腺外分泌腺的線粒體自噬小體的數(shù)量沒(méi)有影響，但是可以明顯增加內(nèi)分泌腺線粒體自噬小體的數(shù)量[16]，說(shuō)明PINK1對(duì)于胰腺外分泌腺的線粒體功能的穩(wěn)定具有一定作用。

3.3 線粒體自噬在細(xì)胞死亡、炎癥和缺血再灌注損傷的作用 關(guān)于自噬是促進(jìn)死亡還是抑制死亡的問(wèn)題，是一直存在爭(zhēng)議的。凋亡（self-killing）被描述為細(xì)胞的程序性死亡，也被成為I型細(xì)胞死亡；而自噬（self-eating）在某些情況下，是一種可以避免細(xì)胞死亡（并可抑制細(xì)胞凋亡）的應(yīng)激適應(yīng)，而在其他環(huán)境中，自噬成為了細(xì)胞死亡的替代途徑， 被稱為自噬性細(xì)胞死亡（或II型細(xì)胞死亡），所以自噬和細(xì)胞死亡之間的關(guān)系是復(fù)雜的[47]。當(dāng)線粒體功能受損時(shí)，線粒體會(huì)釋放出凋亡相關(guān)信號(hào)，激活線粒體凋亡通路，引起細(xì)胞死亡，而同時(shí)功能受損的線粒體會(huì)被線粒體自噬相關(guān)蛋白識(shí)別以清除受損線粒體，減少凋亡信號(hào)的釋放，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。有相關(guān)研究表明，用IL-1b處理人軟骨細(xì)胞以模擬骨關(guān)節(jié)炎，SiRNA干擾Parkin表達(dá)抑制線粒體自噬會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，加重細(xì)胞凋亡[48]，因此認(rèn)為線粒體自噬對(duì)細(xì)胞死亡是有保護(hù)作用的。但是過(guò)度的自噬將會(huì)引起各種溶酶體酶從自噬溶酶體釋放出來(lái)，從而使得細(xì)胞發(fā)生凋亡和/或壞死[49]。對(duì)于細(xì)胞炎癥，相關(guān)研究表明，缺失自噬相關(guān)蛋白Atg16L1可以增強(qiáng)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1b的產(chǎn)生[50]，而在膿毒癥晚期，有學(xué)者認(rèn)為自噬是被耗竭的[51]，也有研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中通過(guò)線粒體自噬清除受損線粒體可以抑制炎癥小體的活化，減輕炎癥反應(yīng)[20]。而線粒體自噬對(duì)缺血再灌注損傷中也起到了保護(hù)性作用，研究發(fā)現(xiàn)腎缺血/再灌注誘導(dǎo)的線粒體自噬通過(guò)Drp1依賴性途徑可以防止腎功能障礙[52]，而B(niǎo)INP3L/NIX介導(dǎo)的線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用，且不依賴PARK2[26]。

4 小結(jié)

通過(guò)線粒體自噬清除線粒體，調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)量以滿足能量代謝的需要，同時(shí)清除受損線粒體以對(duì)線粒體網(wǎng)絡(luò)維持質(zhì)量控制。線粒體自噬通過(guò)幾個(gè)特殊的步驟，將多余的或功能受損的線粒體靶向輸送到自噬小體。在酵母菌中，通過(guò)Atg32向自噬體募集多余和/或受損的線粒體；在哺乳動(dòng)物中，NIX介導(dǎo)紅細(xì)胞成熟過(guò)程中線粒體的發(fā)育性去除，并且parkin/PINK1和FUNDC1可調(diào)節(jié)許多細(xì)胞類型中受損線粒體的選擇性自噬。但是現(xiàn)在很難對(duì)線粒體自噬進(jìn)行精確而定量的檢測(cè)，所以就無(wú)法準(zhǔn)確地評(píng)估線粒體自噬發(fā)生的多少快慢，這是我們所面臨的一個(gè)問(wèn)題。另外線粒體做為細(xì)胞的能量工廠，其生物能量學(xué)主要包括ΔΨ，ATP產(chǎn)生，氧氣消耗和ROS等，其中任意一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，均會(huì)引起線粒體功能障礙，而線粒體自噬通過(guò)控制線粒體的數(shù)量和效率來(lái)調(diào)節(jié)線粒體能量代謝。線粒體的數(shù)量和效率也受線粒體生物合成的控制，但線粒體生物合成和線粒體自噬之間的協(xié)調(diào)仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。圍繞線粒體生物能量學(xué)、線粒體動(dòng)力學(xué)和周轉(zhuǎn)效率的協(xié)調(diào)的這些問(wèn)題將有望為線粒體能量代謝和線粒體自噬的研究提供未來(lái)的方向。