MicroRNA在心血管系統(tǒng)發(fā)育和疾病中作用的研究進展

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種單鏈、非編碼的內(nèi)源性RNA，長度為18～25個核苷酸，通常在轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，通過與信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)互補結(jié)合抑制mRNA翻譯或使其降解，最終引起基因沉默。miRNA在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、凋亡、代謝及腫瘤發(fā)生等多種生理病理進程中均發(fā)揮重要作用[1]。與控制基因表達(dá)開關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子不同，miRNA常通過調(diào)控蛋白翻譯水平改變基因的表達(dá)[1]。一種miRNA可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種功能相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控細(xì)胞發(fā)育過程，同時每個mRNA分子可能被多種miRNA調(diào)節(jié)[2]。從1993年秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個miRNA-lin-4至今，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)2 000余種miRNA。

1 miRNA的作用機制

在細(xì)胞基因組學(xué)中，miRNA基因?qū)儆谶M化保守的一類，可獨立存在或形成多組分復(fù)合物存在，miRNA基因常作為獨立的轉(zhuǎn)錄單位進行轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞核中，miRNA被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為約幾千個堿基對的初始miRNA(pri-mRNA)；pri-mRNA被蛋白復(fù)合物Drosha剪切為約70個核苷酸的前體miRNA(pre-mRNA)；之后核輸出蛋白-5識別pre-mRNA，將其從細(xì)胞核運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，pre-mRNA被RNase Ⅲ 內(nèi)切酶Dicer剪切為近22個核苷酸的雙鏈miRNA[1]。其中一條先導(dǎo)鏈，參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)合成，變?yōu)槌墒靘iRNA；另外一條配對鏈，被降解或合并到細(xì)胞微泡中釋放到細(xì)胞外[3]。RISC效應(yīng)器形成后，miRNA可與靶mRNA結(jié)合。RISC主要與mRNA的3’UTR序列結(jié)合，一旦miRNA-mRNA序列配對正確，RISC中具有核酸內(nèi)切酶活性的Ago2蛋白剪切mRNA，導(dǎo)致其降解；miRNA與mRNA序列配對不完全時，miRNA的翻譯過程被抑制[1]。

2 miRNA在心血管發(fā)育中的作用

在心血管系統(tǒng)中，miRNA調(diào)控心肌細(xì)胞的生長和收縮、心律的發(fā)展與維持、脂質(zhì)代謝和血管生成[4-6]。有研究通過對miRNA基因敲除從而阻斷心血管系統(tǒng)miRNA表達(dá)，有助于了解miRNA在心血管生物學(xué)中的重要性[4]。小鼠敲除Dicer/Drosha/Ago2等重要基因后，由于心臟和血管出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)展缺陷，早期胚胎階段即導(dǎo)致小鼠死亡[7]。

miRNA在不同類型細(xì)胞表達(dá)中具有差異性。心肌細(xì)胞含量最豐富的是miR-1，其中miR-1和miR-133由相同的雙順反子轉(zhuǎn)錄，但心肌細(xì)胞miR-133表達(dá)量低于miR-1。胚胎發(fā)育早期，miR-1和miR-133協(xié)同促進干細(xì)胞中胚層分化；發(fā)展后期，miR-1和miR-133發(fā)揮相反的作用：miR-1促進而miR-133抑制心肌細(xì)胞中胚層分化[8]。miR-1通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Irx5和Hand2表達(dá)影響心臟發(fā)育，靶向敲除miR-1導(dǎo)致室間隔缺損[9]。miR-133影響細(xì)胞周期蛋白D2和血清反應(yīng)因子的活性，細(xì)胞周期蛋白D2通過作用于細(xì)胞G1期成視網(wǎng)膜瘤蛋白的磷酸化控制心肌細(xì)胞的增殖；血清反應(yīng)因子負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)心肌和平滑肌的分化和生長[10]。

心臟發(fā)育期間收縮蛋白的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控。肌球蛋白基因異常成為心室重構(gòu)的病理基礎(chǔ)。肌球蛋白受控于miR-208a、miR-208b、miR-499這三種miRNA，它們分別存在于myh6(alpha-myosin heavy chain，α-MHC)，myh7(beta-myosin heavy chain，β-MHC)和myh7b的內(nèi)含子中[8]。嚙齒類動物中，β-MHC在胚胎發(fā)育期間表達(dá)，α-MHC在出生后表達(dá)，myh7b在上述兩個階段均表達(dá)。miR-208a、miR-208b具有相同的種子序列，說明在不同發(fā)展階段它們調(diào)節(jié)共同的靶基因[11]。成年心臟中，在低氧或甲狀腺功能減退等環(huán)境下，心肌細(xì)胞β-MHC合成物重新表達(dá)。

3 miRNA在血管中的作用

作為血管壁的組分，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞參與維持血管穩(wěn)定。miRNA通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、遷移等促進血管穩(wěn)定，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生。

miR-10a通過調(diào)節(jié)黏附分子表達(dá)調(diào)控促炎內(nèi)皮細(xì)胞表型，miR-10a敲除增強單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白介素(IL)-6、IL-8、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-選擇素等促炎介質(zhì)合成，有研究發(fā)現(xiàn)，主動脈易發(fā)病區(qū)域miR-10a表達(dá)是降低的[5]。參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的其他miRNA分子包括miRNA Let-7g、miR-126等，miRNA Let-7g已被證明是一個重要的抗炎和抗老化分子，通過靶向抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路和Sirt1(與細(xì)胞衰老相關(guān))的相關(guān)基因，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞活化和老化[12]。miR-126在內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，可減少黏附分子表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞間的相互作用從而抑制炎癥反應(yīng)[13]。

血管損傷引起平滑肌細(xì)胞的非正常收縮、增殖和擴張。miR-221通過抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑p27及減少收縮基因α-平滑肌動蛋白(SMA)、平滑肌鈣調(diào)蛋白(CNN)表達(dá)，促進血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖[4]。Zhao等[14]研究指出，內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞miR-143/145的表達(dá)，miR-145通過靶向TGF-β受體Ⅱ，以可變方式調(diào)控TGF-β信號通路。細(xì)胞間接觸刺激后，由內(nèi)皮細(xì)胞衍生的TGF-β介導(dǎo)miR-143及miR-145從平滑肌轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞中。miR-143和miR-145分別靶向調(diào)節(jié)己糖激酶Ⅱ和整合素β-8，由此抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)，降低其增殖能力，維持血管穩(wěn)定性[15]。

4 miRNA在心血管疾病中的作用

4.1 miRNA與高血壓 位于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)中miRNA靶基因在血壓調(diào)節(jié)中是非常重要。miR-155可調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ1型受體(AGTR1)。AGTR1的表達(dá)量與miR-155呈負(fù)相關(guān)，與血壓呈正相關(guān)。中國倉鼠卵巢細(xì)胞miR-155抑制導(dǎo)致AGTR1的上調(diào)，且使細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)活化[16]。miR-155基因位于21號染色體上，三體化21號染色體與血壓降低有關(guān)，患有21三體綜合征同卵雙胞胎病人表現(xiàn)為AGTR1蛋白的低水平表達(dá)與miR-155的高水平表達(dá)[17]，說明miR-155通過對21號染色體的調(diào)控影響血壓水平。

L-精氨酸轉(zhuǎn)運體1(SLC7A1)參與內(nèi)皮功能的紊亂及高血壓的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-122與SLC7A1基因的3’UTR序列有3個或4個潛在的結(jié)合位點。miRNA與3’UTR結(jié)合后，SLC7A1基因表達(dá)抑制，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，最終導(dǎo)致高血壓的發(fā)生和發(fā)展[18]。

4.2 miRNA與心力衰竭 近年來國內(nèi)外研究者普遍認(rèn)為，心力衰竭本質(zhì)是一種分子-臨床綜合征，基因表達(dá)調(diào)控異常與HF的發(fā)病機制密切相關(guān)。肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+循環(huán)失調(diào)和心臟收縮功能受損是心力衰竭的一個重要標(biāo)志，其原因可能是由于蛋白磷酸酶-1(PP-1)去磷酸化活性增加所致。Cai等[19]研究結(jié)果表明，心力衰竭時miR-765過表達(dá)，miR-765通過與蛋白酶抑制劑-1mRNA的3’UTR結(jié)合增加PP-1活性，使其去磷酸化。

Potus等[13]通過研究證明miR-126在由肺動脈高壓(PAH)所致的右心室衰竭過程中發(fā)揮重要作用。miR-126直接靶向作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)子SPRED-1。由于甲基化作用，miR-126在PAH誘導(dǎo)的右心室衰竭病人表達(dá)是下調(diào)的，同時該研究證明高水平miR-126可改善微血管密度，降低纖維化，提高右心室功能。

4.3 miRNA與心肌梗死 心肌梗死是所有冠狀動脈疾病的一個重要標(biāo)志，具有極高的致死率。心肌梗死模型及細(xì)胞中，miRNA存在差異表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在正常心肌細(xì)胞幾乎不表達(dá)，心肌梗死病人心臟組織及心肌梗死大鼠模型梗死周邊區(qū)miR-1表達(dá)明顯上調(diào)，miR-1通過抑制抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)促進心肌細(xì)胞凋亡[20-21]。心肌梗死時miR-24表達(dá)是下調(diào)的，miR-24通過抑制促凋亡蛋白Bim翻譯降低細(xì)胞凋亡[2]。

Xu等[22]研究指出，心肌梗死大鼠模型miR-145表達(dá)下調(diào)，通過慢病毒介導(dǎo)的miR-145過表達(dá)，極大地增強心功能，減少梗死面積，阻止梗死后誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。miR-145可能通過與其靶標(biāo)凋亡相關(guān)蛋白4-抗體(PPCD4)結(jié)合降低線粒體介導(dǎo)凋亡，從而發(fā)揮心臟保護作用。

4.4 miRNA與心室重構(gòu) 心肌與心肌梗死相關(guān)的缺血/再灌注損傷常導(dǎo)致心室重構(gòu)，此過程受各種miRNA調(diào)控。miR-21通過沉默TGF-β受體Ⅲ的基因表達(dá)，升高TGF-β1含量，從而激活TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表達(dá)量，促進成纖維細(xì)胞分化，并分泌大量膠原纖維，參與心室重構(gòu)進程[23]。miR-21可直接上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，從而抑制心肌成纖維細(xì)胞凋亡，促進心肌纖維化。特異性miR-21抑制劑可阻止上述反應(yīng)，避免心肌肥大及纖維化[24]。

分子水平上，成熟的α-MHC轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛サ摩?MHC，導(dǎo)致包括心肌肥大、纖維化等心室重構(gòu)過程的發(fā)生，其中α-MHC內(nèi)含子中的miR-208a與上述過程有關(guān)。miR-208a在心臟中特異表達(dá)，通過作用于靶基因甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白1(THRAP1)發(fā)揮作用[5，24]，其敲除能保護心臟免受壓力條件下的病理學(xué)重構(gòu)。將miR-208a抑制劑靶向轉(zhuǎn)移至高血壓小鼠中，可延遲其誘導(dǎo)的心功能損害，說明miR-208a抑制劑可作為心血管疾病的潛在治療藥物[25]。

4.5 miRNA與心律失常 心律失常即心臟活動的起源和(或)傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致心臟搏動的頻率和(或)節(jié)律異常，是心血管疾病重要的一組疾病。連接蛋白43(conexin43，Cx43)是由GJA1基因編碼的具有心室細(xì)胞間傳導(dǎo)功能的心肌縫隙連接作用(IK1通道)；Kir2.1通道是由KCNJ2基因編碼的，具有調(diào)節(jié)和維持心臟細(xì)胞膜電位功能的通道[26]。缺血性心肌病miR-1表達(dá)升高，miR-1通過抑制GJA1和KCNJ2表達(dá)而使Cx43和Kir2.1產(chǎn)物減少，從而導(dǎo)致心律失常發(fā)生。

HCN2和HCN4屬于超極化激活的循環(huán)核苷酸門控通道(HCN)基因家族，它們控制心臟起搏電流(If)，與心臟自律性密切相關(guān)。心肌肥厚和心力衰竭病人HCN2和HCN4表達(dá)量明顯增高，易導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。HCN2和HCN4分別受miR-1和miR-133的靶向抑制調(diào)節(jié)，Luo等[27]通過研究發(fā)現(xiàn)，miR-1和miR-133表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致HCN2和HCN4過表達(dá)，從而導(dǎo)致肥厚性心肌病電重構(gòu)的發(fā)生。因此，miRNA通過對靶基因調(diào)節(jié)影響心臟自律性，進而發(fā)揮抗心律失常作用。

5 小 結(jié)

miRNA的發(fā)現(xiàn)改變了對基因表達(dá)調(diào)控的常規(guī)理解。隨著對miRNA了解的深入，如何將其更好地運用于臨床診斷與治療尤為重要。miRNA已廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床診斷與治療領(lǐng)域，如某種腫瘤miRNA的特異性變化視為信號標(biāo)志物，為腫瘤進展及病人存活時間等提供依據(jù)。心血管系統(tǒng)中，miRNA通過調(diào)控細(xì)胞分化、遷移和增殖等影響心血管發(fā)育和各種心血管疾病等病理生理過程。相關(guān)實驗報道，miRNA對動物模型及人體毒性微乎其微，因此在疾病治療方面發(fā)揮巨大的潛力。

采用miRNA治療疾病通常有兩種途徑，一種是抑制體內(nèi)異常表達(dá)的miRNA，從而使機體某些生理功能恢復(fù)正常；另一種是通過miRNA過表達(dá)，沉默體內(nèi)異常表達(dá)基因，保護機體的相應(yīng)功能免受損害。已有部分基于miRNA合成的藥物達(dá)到臨床研究階段，如用于治療丙型肝炎(HCV)的miR-122抑制劑已進入二期臨床研究階段[28]。miR-122在肝細(xì)胞特有而且是HCV復(fù)制的必需物，miR-122抑制劑的使用可降低病毒復(fù)制數(shù)量，緩解HCV病程[29-30]。然而，利用miRNA在不同心血管疾病的差異表達(dá)設(shè)計的藥物目前尚未用于臨床治療中。心血管疾病是一種致死性疾病，發(fā)展新的治療和診斷方法很有必要，而miRNA在心血管生物學(xué)及心血管疾病中的獨特作用使其成為極具前景的研究靶向。