中藥影響缺血-再灌注損傷心肌自噬的研究進(jìn)展

血運(yùn)重建是近年來冠心病治療領(lǐng)域的重大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建手術(shù)逐年增加，2016年我國(guó)冠心病介入治療的總例數(shù)為666 495例[1]，冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建術(shù)改善了病人的近期預(yù)后與生存質(zhì)量。但是，血運(yùn)重建術(shù)后近期的再灌注損傷、冠狀動(dòng)脈無復(fù)流，遠(yuǎn)期的支架內(nèi)再狹窄等問題仍存在，影響血運(yùn)重建的臨床效果及病人的生活質(zhì)量。近年來，已有不少學(xué)者對(duì)中藥干預(yù)缺血后再灌注損傷的療效及其機(jī)制、中藥影響心肌細(xì)胞自噬機(jī)制進(jìn)行研究，現(xiàn)將有關(guān)進(jìn)展概述如下。

1 再灌注損傷與心肌自噬

自噬是細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，自噬是一種溶酶體依賴性降解途徑，其發(fā)生與多種分子相關(guān)，在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用[2]。在基礎(chǔ)狀態(tài)下自噬參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，在構(gòu)成正常水平的蛋白質(zhì)質(zhì)量調(diào)控和保持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能方面發(fā)揮著重要作用，然而自噬過度或不足導(dǎo)致的異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積，可能直接損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心臟功能異常。

正常情況下，心肌自噬維持在一定的水平，這種基礎(chǔ)水平自噬是一種分解代謝平衡途徑，對(duì)減少心肌細(xì)胞死亡，維持心臟功能具有重要作用。心肌細(xì)胞的再分化能力非常有限，細(xì)胞生存過程中不可避免會(huì)產(chǎn)生功能異常或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器衰老或受損，自噬可以降解細(xì)胞內(nèi)功能異常或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)及受損衰老細(xì)胞器，為細(xì)胞提供能量，促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)及細(xì)胞自我更新。在心肌缺血階段，基礎(chǔ)水平的細(xì)胞自噬可以降解受損傷的物質(zhì)，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及能量，從而對(duì)缺血心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，避免其壞死或凋亡。若自噬下調(diào)，大量有害物質(zhì)則會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受損及死亡，加重疾病的發(fā)展。

在某些特殊情形下，細(xì)胞自噬水平上調(diào)，如在低氧、線粒體功能障礙或感染等情況下，自噬水平增高，從而清除受損線粒體，避免凋亡因子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)提高細(xì)胞對(duì)低氧的耐受力，對(duì)細(xì)胞起一定保護(hù)作用；心肌缺血時(shí)自噬水平提高，分解受損細(xì)胞器或異常蛋白質(zhì)為心肌代謝提供能量，維持心肌收縮力。自噬上調(diào)過度則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入死亡程序，從而加劇疾病發(fā)展，尤其在心肌缺血后再灌注階段，自噬過度激活，反而會(huì)降解正常的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，破壞細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞死亡[3]。

避免過度細(xì)胞自噬可保護(hù)損傷心肌，減少壞死或凋亡。樊理華等[4]在動(dòng)物試驗(yàn)中采用夾閉股動(dòng)脈的方法制作肢體缺血再灌注模型，觀察心肌細(xì)胞凋亡情況以及LC3-Ⅱ的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理組(IPR組)細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，證實(shí)了缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，這關(guān)鍵在于減輕了大鼠肢體缺血再灌注心肌細(xì)胞自噬。王智華等[5]在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)舒芬太尼后處理使LC3-Ⅱ表達(dá)減少，并可能通過激活PI3K-Akt通路而抑制自噬水平，從而在心肌缺血再灌注損傷中起到保護(hù)作用。葉紅偉等[6]制作離體大鼠心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)模型，觀察自噬在法舒地爾(fasudil)抑制Rho激酶心肌保護(hù)中的變化，發(fā)現(xiàn)抑制Rho激酶心肌保護(hù)作用中誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生，最終發(fā)揮保護(hù)心肌作用。Aisa等[7]在心肌梗死動(dòng)物模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，急性心肌梗死(AMI)組左室梗死面積明顯增大，梗死周圍區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯提升，p62明顯增高，相比AMI組，雷帕霉素(RAPA)治療組左室梗死面積明顯減小，梗死周圍區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯提升，p62表達(dá)水平明顯降低，表明自噬可減少左前降支結(jié)扎后心肌梗死面積，改善心功能。這一研究提示調(diào)控缺血心肌的自噬水平，可以起到保護(hù)心肌、減輕心肌損傷的作用。

2 細(xì)胞自噬與陰平陽秘

細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抵御損傷的生物機(jī)制，有學(xué)者運(yùn)用中醫(yī)氣血理論、陰陽平衡理論、痰瘀病因?qū)W說對(duì)其進(jìn)行分析。李欣志等[8]認(rèn)為陰陽自和是人體的一種自主修復(fù)能力，當(dāng)心臟陰陽失和，心肌細(xì)胞功能失?；驍?shù)量減少，則誘發(fā)細(xì)胞自噬作用，以消除受損細(xì)胞器，產(chǎn)生新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，協(xié)助細(xì)胞度過缺血期，發(fā)揮自我保護(hù)作用，認(rèn)為心肌自噬與中醫(yī)陰陽失和存在密切聯(lián)系。

黃麗瓊等[9]認(rèn)為細(xì)胞自噬功能可能是氣維持生命活動(dòng)功能發(fā)揮的微觀表現(xiàn)，自噬的過度與不足為氣的陽化和陰化得太過與不及，表現(xiàn)為氣的氣化功能，自噬清除“垃圾”產(chǎn)物并保護(hù)受損細(xì)胞的機(jī)制表現(xiàn)為氣的防御功能，自噬對(duì)細(xì)胞分子的調(diào)控以感應(yīng)傳導(dǎo)信息，維持和調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定則表現(xiàn)為氣的中介、推動(dòng)和調(diào)控作用。黃貴華等[10]認(rèn)為自噬是對(duì)機(jī)體正虛邪實(shí)做出的一種自我調(diào)節(jié)方式，是正氣虧虛下的自救方式，也是機(jī)體轉(zhuǎn)化、消除內(nèi)生邪實(shí)的過程。劉杰民等[11]進(jìn)一步提出，細(xì)胞自噬與中醫(yī)在氣虛的情況下“精化氣”以維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)，以及在臟腑功能失調(diào)情況下，內(nèi)生痰濁瘀血之邪實(shí)的自我清除以維持內(nèi)環(huán)境陰陽平衡的機(jī)制相一致。以上研究說明心肌自噬與中醫(yī)氣虛證候相聯(lián)系。

也有醫(yī)家認(rèn)為在細(xì)胞自噬的“自我消化”過程中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及糖等飲食精微轉(zhuǎn)化過量，則生成濁邪，濁邪瘀滯，不能得到及時(shí)有效的控制或改善，從而導(dǎo)致痰瘀病理產(chǎn)物[12]。

3 中藥對(duì)病理狀態(tài)下心肌自噬的影響

有學(xué)者已經(jīng)關(guān)注心肌自噬機(jī)制與中藥治療心血管疾病療效的關(guān)系，并通過在體與離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)研究。

3.1 中藥復(fù)方

3.1.1 加味丹參飲 加味丹參飲以補(bǔ)氣活血為法，由丹參20 g、黃芪20 g、赤芍10 g、檀香6 g、紅花6 g、當(dāng)歸6 g、川芎6 g等藥組成，饒春梅等[13]將體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組，建立心肌缺氧/復(fù)氧模型，給予空白血清、加味丹參飲含藥血清、3-甲基腺嘌呤10 mmol/L、雷帕霉素100 nmol/L等處理，觀察心肌細(xì)胞自噬體形態(tài)及數(shù)量變化，各組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1表達(dá)。結(jié)果顯示，與缺氧/復(fù)氧組相比，含藥血清組以及含藥血清+自噬激動(dòng)劑組鏡下心肌細(xì)胞變性壞死程度減輕，電鏡下自噬體數(shù)量增多，培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)漏出率明顯降低，LC3-Ⅱ及Beclin-1蛋白表達(dá)上升(P<0.05)。提示加味丹參飲可能通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin-1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞自噬，保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞。

3.1.2 痰瘀同治方 痰瘀同治方由瓜蔞、薤白、清半夏、柴胡、赤芍、川芎、黃連、甘草等組成，唐丹麗等[14]研究痰瘀同治方作用機(jī)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示痰瘀同治方通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化，改善心肌細(xì)胞凋亡，抑制自噬而達(dá)到保護(hù)心肌的作用，為進(jìn)一步探討痰瘀同治方對(duì)心肌缺血再灌注損傷(I/R)過程不同階段自噬的調(diào)控作用，研究組將預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠通過可逆性冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎制作心肌缺血(MI)及I/R模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，痰瘀同治組能降低缺血期血清肌酸激酶(CK)及再灌注期CK、LDH含量(P<0.05)，抑制缺血期Beclin-1mRNA及再灌注期Beclin-1、LC3mRNA的表達(dá)，上調(diào)缺血期及再灌注期Bcl-2mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，這表明痰瘀同治方通過促進(jìn)缺血期自噬發(fā)生及抑制再灌注期自噬過表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)而發(fā)揮其對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用[15]。為闡明其作用機(jī)制，研究組緊接著通過體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，各組給予相應(yīng)方劑腸吸收液18 mg/mL孵育2 h后給予缺氧復(fù)氧(H/R)處理，電鏡下觀察細(xì)胞自噬體結(jié)構(gòu)，檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH釋放量和超氧物歧化酶(SOD)活性及細(xì)胞內(nèi)LC3、Beclin-1、P-AMPK和P-mTOR蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與H/R模型組比較，各中藥組干預(yù)后均能降低LDH、Beclin-1表達(dá)，同時(shí)痰瘀同治方組可提高SOD活性，抑制LC3高表達(dá)，下調(diào)p-AMPK水平，并上調(diào)p-mTOR蛋白表達(dá)，從而表明缺氧復(fù)氧可激活心肌細(xì)胞AMPK-mTOR信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)自噬過度表達(dá)加重心肌損傷，痰瘀同治方可通過調(diào)控AMPK-mTOR通路、抑制自噬而起到心肌保護(hù)作用[16]。

3.1.3 芪藶強(qiáng)心膠囊 芪藶強(qiáng)心膠囊具有益氣溫陽、活血通絡(luò)、利水消腫的功效，常用于冠心病、高血壓等。Tong等[17]為探討中藥芪藶強(qiáng)心(QLQX)在糖尿病小鼠心功能中的潛在作用及血管緊張素Ⅱ受體1型(AGTR1)和瞬時(shí)受體電位1型(TRPV1)在糖尿病小鼠心功能中的作用，對(duì)鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腹腔注射血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)或腹腔注射losartan(Los)來評(píng)估AGTR1和TRPV1的活性，并監(jiān)測(cè)心功能及自噬相關(guān)標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠心臟中，TRPV1和自噬標(biāo)志物表達(dá)和自噬溶酶體數(shù)量減少，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶1和AGTR1表達(dá)增加，用Los阻斷AGTR1模擬QLQX介導(dǎo)的心功能改善，減輕心肌纖維化和啟動(dòng)自噬，而AngⅡ消除了QLQX在野生型糖尿病小鼠中的有益作用，但TRPV1糖尿病小鼠中未發(fā)現(xiàn)，這表明在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，QLQX可通過調(diào)控AGTR1/TRPV1介導(dǎo)的自噬來改善糖尿病心功能。

3.1.4 化痰祛瘀解毒通脈顆粒 化痰祛瘀解毒通脈顆粒是針對(duì)痰、瘀、毒三因素組方而成的，本方以丹參為君，川芎、人參為臣，澤瀉、黃連為佐，山楂、紅曲為使。范曉迪[18]小鼠實(shí)驗(yàn)證明本方可以有效改善動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊形成，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究結(jié)果顯示，化痰祛瘀解毒通脈顆粒具有明顯抗AS作用，該方藥中主要活性成分丹酚酸A(SAA)、小檗堿(BBR)、洛伐他汀(LOV)可能依賴打開AMPK-mTOR、抑制AKT-mTOR信號(hào)通路激活自噬途徑，從而抑制模型細(xì)胞分泌炎性因子的作用。證實(shí)了化痰祛瘀解毒方藥調(diào)控細(xì)胞自噬，可能是發(fā)揮抗AS作用的重要途徑之一。

3.1.5 血府逐瘀湯 血府逐瘀湯是著名活血化瘀方劑，臨床用于治療多種心血管疾病。Shi等[19]將H9C2細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)，在不同濃度的血府逐瘀湯下培養(yǎng)12 h，測(cè)定細(xì)胞活力、LDH釋放到細(xì)胞外液中的量，證實(shí)了血府逐瘀湯對(duì)H/R細(xì)胞模型的保護(hù)作用，檢測(cè)細(xì)胞凋亡以及H9C2細(xì)胞的自噬水平及相關(guān)通路，結(jié)果顯示，血府逐瘀湯處理后明顯抑制H/R誘導(dǎo)的自噬，自噬體形成減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1表達(dá)減少，另外血府逐瘀湯抑制自噬可增強(qiáng)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，抑制AMPK活化，上調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化作用。這表明血府逐瘀湯在H/R期間的心臟保護(hù)作用是通過調(diào)控AMPK-mTOR信號(hào)通路抑制自噬介導(dǎo)發(fā)揮作用的。

3.2 中藥單成分

3.2.1 葒草苷 葒草苷是苗藥都木油的有效成分，具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等藥理作用。劉立亞等[20]在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用預(yù)給藥方式研究葒草苷對(duì)細(xì)胞自噬的影響，采用Langendorff法，建立大鼠離體心臟I/R模型，對(duì)大鼠預(yù)給不同劑量的葒草苷，結(jié)果表明，葒草苷可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)上升，且增加心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量，對(duì)I/R損傷的心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。此外，通過加用自噬抑制劑渥曼青霉素的方法，發(fā)現(xiàn)與葒草苷組比較，加用自噬抑制劑后，心臟血流動(dòng)力水平降低，心肌酶水平增高，心肌肌纖維紊亂，部分肌絲溶解斷裂，線粒體腫脹，嵴稀疏紊亂，并且使心肌凋亡水平上升，這都從側(cè)面證明葒草苷的心肌細(xì)胞保護(hù)作用可能與細(xì)胞自噬有關(guān)，但其具體作用機(jī)制有待深入研究。

3.2.2 丹參酚酸B 丹參是一種重要的傳統(tǒng)中草藥，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰等功效，被廣泛用于冠心病等心血管疾病的治療。丹參的主要水溶性成分之一丹參酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是丹參最豐富的生物活性成分。Lin等[21]為探討Sal B對(duì)大鼠AMI的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察急性心肌梗死大鼠的病理變化，檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬和凋亡及凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白和血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與模型組相比，Sal B組心肌梗死明顯減輕，大鼠梗死抑制率較高，梗死面積較小，血清CK、LDH和丙二醛水平下降，而SOD水平明顯升高，Sal B抑制Bax、cleaved caspase-9和cleaved PARP的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。這表明Sal B對(duì)AMI有心血管保護(hù)作用。

3.2.3 紅景天苷 紅景天是主要生長(zhǎng)于高原地區(qū)的一種補(bǔ)氣藥，其主要成分紅景天苷，具有緩解壓力所致的心血管組織損傷及功能紊亂、調(diào)節(jié)心肌代謝等作用，其作用廣泛，療效明顯。許璨[22]研究認(rèn)為，高濃度葡萄糖抑制了心肌細(xì)胞的自噬，誘導(dǎo)其凋亡，而紅景天苷通過上調(diào)mTOR通路恢復(fù)心肌細(xì)胞自噬活性，拮抗高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的凋亡。

3.2.4 九龍?zhí)冱S酮(Bauhinia championii flavones，BCF) 九龍?zhí)偈菑V西特色中草藥，其主要成分九龍?zhí)倏傸S酮具有較強(qiáng)的抗感染、抗氧化及保護(hù)心肌組織急性缺血性損傷的作用。孫瑤[23]以自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ，自噬相關(guān)蛋白Beclin-Ⅰ、mTOR為主要指標(biāo)，通過大鼠舌下靜脈給藥10 min后冠狀動(dòng)脈結(jié)扎方式建立I/R模型，觀測(cè)心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BCF可能通過缺血期誘導(dǎo)自噬發(fā)生和再灌注期抑制自噬過表達(dá)從而發(fā)揮抗心肌缺血/再灌注損傷作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Beclin-1蛋白表達(dá)和上調(diào)mTOR蛋白表達(dá)有關(guān)。

3.2.5 黃芪甲苷(Astragaloside，AS) 黃芪甲苷為黃芪多糖的主要成分，也是中藥黃芪的最主要有效成分。黃莉等[24]在觀察黃芪甲苷對(duì)心肌細(xì)胞自噬及急性缺血性心肌損傷的治療作用及機(jī)制實(shí)驗(yàn)中，通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈建立心肌缺血再灌注損傷模型，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)及免疫組織化學(xué)法，觀察黃芪甲苷處理后的心肌組織損傷、細(xì)胞自噬的變化。結(jié)果顯示，黃芪甲苷組可使心肌灶性病變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的面積明顯減少(P<0.05)，缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌組織細(xì)胞Beclin1表達(dá)降低(P<0.05)。證實(shí)了黃芪甲苷可在一定程度上減少缺血損傷的心肌面積，其機(jī)制與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)有關(guān)。

自噬作為真核內(nèi)穩(wěn)定的機(jī)制，受精細(xì)調(diào)控，心肌自噬在缺血性心臟病中的作用關(guān)系著發(fā)病、病程進(jìn)展及預(yù)后，現(xiàn)有研究提示益氣活血化痰解毒類中藥，可能影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌細(xì)胞自噬機(jī)制，而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化及保護(hù)缺血再灌注損傷的作用，在臨床有效的基礎(chǔ)上，明確益氣活血、化痰解毒中藥的作用機(jī)制，對(duì)豐富中醫(yī)理論，優(yōu)化提高臨床療效的中藥復(fù)方或組分配伍復(fù)方具有重要的意義，為中醫(yī)藥防治冠心病的藥物開發(fā)提供新的思路。