基于質(zhì)譜技術(shù)的乳腺癌代謝組學(xué)研究進(jìn)展

(1.南華大學(xué)，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，湖南 郴州 423000)

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤和癌癥死亡原因，是一個(gè)世界性的女性健康問題，占所有女性癌癥病例的1/4[1]。在我國(guó)，隨著環(huán)境改變以及工作壓力增加，乳腺癌患病率逐年上升且呈年輕化。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素過程，除遺傳因素外，年齡、生育與否、飲食和環(huán)境、外源性雌激素都能影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展[2]。早期乳腺癌治愈率可達(dá)90%，然而大多數(shù)乳腺癌在發(fā)現(xiàn)之時(shí)已到中晚期，因此，建立早期診斷和有效篩查方法能改善乳腺癌患者生存率。目前推薦的乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS)檢查和分期方法包括病史和體格檢查，雙側(cè)乳腺X線檢查，病理學(xué)評(píng)估，腫瘤雌激素受體(ER)狀態(tài)的確定以及MRI表現(xiàn)[3]，現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)成熟、臨床應(yīng)用廣泛，但其敏感性及特異性較差。鑒于乳腺癌的高發(fā)病率和高死亡率，迫切需要開發(fā)出方便、快速、高敏感性和特異性的新技術(shù)來尋找診斷、預(yù)后、分期、治療反應(yīng)和治療靶點(diǎn)的生物標(biāo)志物，以便有效提高乳腺癌的臨床治愈率。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新分支，它通過研究受刺激或受干擾的生物體(如基因突變或病理生理狀態(tài))的代謝產(chǎn)物譜及其動(dòng)態(tài)變化來揭示機(jī)體的代謝網(wǎng)絡(luò)[4]。代謝組學(xué)的研究過程包括生物樣本采集、代謝產(chǎn)物的檢測(cè)與鑒定、數(shù)據(jù)分析以及生物學(xué)信息的挖掘及闡釋。其研究對(duì)象為復(fù)雜的生物體系，常見的生物樣本包括生物體液(尿液、血液、唾液、膽汁等)、動(dòng)物或人體組織(腫瘤、肝臟、脂肪組織等)以及細(xì)胞。代謝組學(xué)以其高靈敏度、高分辨率、高通量的技術(shù)特點(diǎn)以及無創(chuàng)、利于實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)在癌癥研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展?jié)摿?。腫瘤生物標(biāo)志物能夠反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)與預(yù)后的情況，對(duì)腫瘤的早期診斷、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后監(jiān)控等方面具有重要價(jià)值[5]。

腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與代謝物的改變密切相關(guān)，在乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程中，乳腺癌細(xì)胞的代謝組發(fā)生了一系列深刻的重組，這種代謝改變是由基因組計(jì)劃調(diào)控的，并受到腫瘤微環(huán)境的影響，代謝改變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，表現(xiàn)出對(duì)特定代謝途徑的依賴，主要是在能量代謝和生物合成過程中發(fā)生的代謝網(wǎng)絡(luò)變化[6]，因此，代謝組學(xué)可以在乳腺癌的早期篩查、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、療效評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮重要作用，并且已取得一定的進(jìn)展，有望為乳腺癌的診斷治療提供新的思路。

1 代謝組學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)

代謝組學(xué)是指由于遺傳信息的變化、生物的刺激或者病理生理的影響導(dǎo)致生物體系內(nèi)的總體動(dòng)態(tài)改變，成為了繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后系統(tǒng)生物學(xué)研究的又一重要領(lǐng)域。通常研究代謝組學(xué)有兩種方法[7]:(1)相對(duì)較慢的技術(shù)，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)信息，從而識(shí)別代謝產(chǎn)物，如核磁共振(NMR)；(2)相對(duì)快速識(shí)別診斷信號(hào)的方法，如質(zhì)譜法(MS)。

質(zhì)譜法(MS)又分為液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)及氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)，其中LC-MS是最靈敏的生物分子檢測(cè)技術(shù)，而GC-MS技術(shù)提供了一個(gè)相對(duì)更全面的色譜技術(shù)和具有更高的分離效率以及可用的參考化合物文庫(kù)。GC-MS和LC-MS的相互結(jié)合應(yīng)用可以更好地表達(dá)不同類別的化合物。

2 質(zhì)譜技術(shù)在乳腺癌代謝組學(xué)中的應(yīng)用

2.1 乳腺癌的篩查

不同的代謝轉(zhuǎn)化對(duì)癌細(xì)胞維持高增殖率和抵抗細(xì)胞死亡信號(hào)至關(guān)重要。這種代謝轉(zhuǎn)化導(dǎo)致獨(dú)特的細(xì)胞代謝表型，通常由腫瘤中不同的代謝標(biāo)記物以及循環(huán)血液反映。因此,對(duì)這些變化的代謝物進(jìn)行分析和檢測(cè),能夠有效地鑒別出與疾病狀態(tài)相關(guān)的生物標(biāo)志物,有助于臨床疾病的篩查診斷。基于血清或血漿的代謝組學(xué)是一種很有潛力的乳腺癌診斷方法。在乳腺癌患者血液中存在代謝組學(xué)標(biāo)記物，乳腺癌患者代謝譜中描述的變化可能以不同方式影響疾病生物學(xué)，可以通過改變腫瘤的分化狀態(tài)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移表型或促使腫瘤在氧化應(yīng)激條件下更有活力，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[8]。來自乳腺癌患者血液中的代謝組學(xué)研究對(duì)乳腺癌的篩查和診斷是具有一定的可行性的。代謝生物標(biāo)志物被證明可以鑒別乳腺癌和正常樣本，并且具有極高的敏感性和特異性，這可能會(huì)成為新的篩查和診斷乳腺癌的方法。

Huang等[9]使用液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-TOF-MS)和氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)研究了乳腺癌診斷的關(guān)鍵代謝通路特征，開發(fā)了一種新的基于代謝途徑的疾病診斷代謝組學(xué)模型，所得的全期和早期診斷模型是高度準(zhǔn)確的，平均AUC(曲線下面積，受試者操作特征曲線)為0.968和0.934，靈敏度為0.946和0.954，特異性為0.934和0.918。Wang等[10]基于DBS(Dried Blood Spot)的MS代謝組學(xué)分析了258例新確診的乳腺癌患者以及159例良性乳腺疾病患者(包括78名健康人)的血液代謝物來篩選具有乳腺癌診斷潛力的代謝標(biāo)志物，建立了一個(gè)由Pip、Asn、Pro、C14:1/C16、Phe/Tyr和Gly/Ala六個(gè)血液參數(shù)組成的診斷模型，該模型區(qū)分乳腺癌和非乳腺癌的靈敏度和特異性分別為92.2%和84.4%。

Takayama等[11]通過超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測(cè)定唾液中的多胺(包括它們的乙?；问?，發(fā)現(xiàn)有八種多胺(如SPM，CAD，Ac-SPM，N1-Ac-SPD，N8-Ac-SPD)與癌癥患者強(qiáng)相關(guān)。一個(gè)簡(jiǎn)單的一階方程(Y=0.5XSPM-3XAc-SPM-0.15XSPD-3.5XN8-Ac-SPD+0.5XN1-Ac-SPD+0.04XCAD)被用來區(qū)分乳腺癌患者和健康人群，采用N8-Ac-SPD/(N1-Ac-SPD+N8-Ac-SPD)比值進(jìn)行ROC分析，其敏感性和特異性均接近80%。Johnson等[12]通過MS對(duì)MCF-7乳腺癌異種移植小鼠模型尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)酯葡萄糖醛酸、香豆酸硫酸酯、癸酸葡糖苷酸、?；撬岵町惐磉_(dá)顯著，揭示了腫瘤生長(zhǎng)與脂肪酸合成和腸道微生物代謝產(chǎn)物的潛在抗增殖作用之間存在相關(guān)性。表明對(duì)于乳腺癌患者的非侵入性體液診斷是有用的，可能成為臨床檢查的支持方法之一。

2.2 乳腺癌的分型

根據(jù)基因改變可將乳腺癌分為五個(gè)分子亞型：Luminal A、Luminal B、Luminal B HER2陽(yáng)性(人類表皮生長(zhǎng)因子受體2)富集、HER2過表達(dá)和三陰性乳腺癌[13]。由于乳腺癌的高度異質(zhì)性，對(duì)代謝途徑的理解仍然不夠充分。針對(duì)不同的乳腺癌亞型患者經(jīng)常會(huì)采用不同的治療方案,然而,即使針對(duì)同一亞型的乳腺癌患者也常會(huì)出現(xiàn)預(yù)后效果存在較大差異的情況。同時(shí)，雖然致癌基因和抑癌基因的突變被認(rèn)為是惡性增長(zhǎng)的最終原因，但細(xì)胞代謝變化是其對(duì)遺傳變化與細(xì)胞生理學(xué)功能改變的應(yīng)答，目前，臨床試驗(yàn)正在研究靶向糖酵解，谷氨酸分解，脂肪酸合成，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)信號(hào)傳導(dǎo)和其他途徑的代謝藥物。因此，為了確定從代謝藥物中獲益最多的患者群體，分析乳腺癌不同亞型的代謝變化譜非常重要。

為分析乳腺癌細(xì)胞系亞型之間的中心代謝差異，Willmann等[14]用氣相色譜-電子轟擊離子源-質(zhì)譜(GC-EI-MS)對(duì)乳腺癌與乳腺上皮細(xì)胞系進(jìn)行代謝組學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)在氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)和糖酵解中存在顯著差異。所得數(shù)據(jù)可用于研究細(xì)胞系的PCA分類和乳腺癌與乳腺上皮細(xì)胞系的PLS-DA鑒別。Budczies等[15]用GC-TOF-MS研究了ER+和ER-乳腺癌患者組織的代謝組學(xué)。發(fā)現(xiàn)在ER+亞型中β-丙氨酸，2-羥基戊二酸，谷氨酸，黃嘌呤增加，谷氨酰胺減少。其中β-丙氨酸和谷氨酰胺變化最顯著，β-丙氨酸和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(ABAT)表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

Fan等[16]通過LC-MS和GC-MS測(cè)定乳腺癌患者和正常人的血漿代謝譜，鑒定了包括肉堿、溶血磷脂酰膽堿(20∶4)、脯氨酸、丙氨酸、溶血磷脂酰膽堿(16∶1)、糖原脫氧膽酸、纈氨酸和2-辛烯二酸等8種差異代謝物用于乳腺癌亞型的診斷。表明乳腺癌亞型的特征可能與其個(gè)體代謝特征相關(guān)，代謝物濃度的差異可能有助于乳腺癌的診斷以及乳腺癌亞型的確定。

2.3 乳腺癌的治療靶點(diǎn)研究

腫瘤細(xì)胞代謝重編程能平衡細(xì)胞能量需求和合成代謝，有助于疾病的進(jìn)展。與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，快速增殖的惡性細(xì)胞的代謝需求差異表明靶向代謝可能是開發(fā)新型癌癥治療的潛在策略。癌細(xì)胞可以表現(xiàn)出對(duì)特定代謝途徑的依賴，以這些代謝途徑為靶點(diǎn)是一個(gè)很有前途的治療策略。開發(fā)利用代謝缺陷的新治療方法的關(guān)鍵步驟是識(shí)別與特定惡性腫瘤相關(guān)的代謝改變。代謝組學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步使得測(cè)量廣譜細(xì)胞代謝物成為可能，并提供了一種鑒定與癌癥相關(guān)的特定代謝改變的方法。

Beatty等[17]應(yīng)用GC-MS與LC-MS對(duì)三陰性乳腺癌(TNBC)和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。代謝圖譜揭示了兩種主要的TNBC代謝亞型，其中非基底細(xì)胞樣TNBC細(xì)胞系表現(xiàn)出對(duì)谷胱甘肽生物合成的相對(duì)較強(qiáng)的依賴性，以維持足夠的抗氧化能力從而支持腫瘤發(fā)生。表明谷胱甘肽生物合成途徑是TNBC的治療靶點(diǎn)，并以此為基礎(chǔ)確定了谷胱甘肽抑制劑(BSO)和柳氮磺胺吡啶(SASP)聯(lián)合治療的合理性——通過減少谷胱甘肽的合成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。非靶向代謝組分析可以識(shí)別差異表達(dá)的代謝產(chǎn)物，這些代謝通路的依賴性可以指向新的治療策略。

大多數(shù)癌細(xì)胞對(duì)甲硫氨酸具有獨(dú)特的代謝需求，當(dāng)甲硫氨酸被其代謝前體同型半胱氨酸替代時(shí)，癌細(xì)胞無法增殖。Borrego等[18]通過氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜法(GC-TOFMS)對(duì)同型半胱氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468及其甲硫氨酸不敏感衍生細(xì)胞系MDA-MB-468res-R8進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究其對(duì)甲硫氨酸應(yīng)激的代謝反應(yīng)。確定了兩種細(xì)胞系之間獨(dú)特的代謝反應(yīng)，包括甲硫氨酸補(bǔ)救，嘌呤/嘧啶合成和三羧酸循環(huán)。MDAMB-468res-R8細(xì)胞比MDA-MB468細(xì)胞更早地響應(yīng)這種細(xì)胞應(yīng)激，更好地滿足代謝需求。揭示了與乳腺癌甲硫氨酸依賴性有關(guān)的代謝表型的動(dòng)態(tài)變化，并進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為腫瘤發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子的重要性可能成為治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。

2.4 乳腺癌的治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)

由于乳腺癌是一種臨床異質(zhì)性疾病，在進(jìn)行臨床治療時(shí)常導(dǎo)致不同的預(yù)后。識(shí)別對(duì)化療有反應(yīng)者并因此提高病人長(zhǎng)期生存率對(duì)治療方案有重要意義，而識(shí)別對(duì)化療無反應(yīng)者則可及時(shí)改用其它可能的有效治療手段。乳腺癌代謝組學(xué)研究可以揭示乳腺癌代謝特征，鑒定乳腺癌新輔助化療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物，為乳腺癌治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)提供重要依據(jù)。

?；撬崾亲钬S富的游離氨基酸，參與人體許多重要的生物過程，并已被證明具有抗乳腺癌和其他腫瘤的活性。He等[19]用高通量氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HT GC-TOFMS)研究?；撬嵩谌橄侔┲械淖饔脵C(jī)制，鑒定出23種差異代謝物，分別參與能量、葡萄糖、氨基酸和核酸代謝，表明?；撬岬目鼓[瘤活性是通過對(duì)乳腺癌細(xì)胞代謝的改變調(diào)節(jié)的。這些差異代謝物可能是監(jiān)測(cè)癌癥治療和臨床預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究牛磺酸的抗腫瘤機(jī)制及開發(fā)治療乳腺癌的新策略提供了科學(xué)依據(jù)。

內(nèi)源性雌酮水平與絕經(jīng)后乳腺癌的發(fā)病率顯著相關(guān)。Kim等[20]應(yīng)用高靈敏度的質(zhì)量輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI-MS)定量平臺(tái)檢測(cè)內(nèi)源性雌激素，成功地監(jiān)測(cè)了由芳香酶抑制劑處理導(dǎo)致的MCF-7細(xì)胞中雌酮的代謝表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明MALDI-MS定量方法可能是含酮代謝物的靶向代謝組學(xué)的一般方法，可以反映臨床條件和致病機(jī)理，用于臨床上疾病的治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

綜前所述,基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)在乳腺癌的早期篩查、臨床分型、潛在治療靶點(diǎn)研究、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后監(jiān)測(cè)等相關(guān)的代謝性生物標(biāo)志物研究方面已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成果,但也面臨著不少挑戰(zhàn),例如(1)應(yīng)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)整合,建立從基因水平、蛋白功能水平到終端代謝產(chǎn)物水平的系統(tǒng)模型,從系統(tǒng)生物學(xué)角度對(duì)乳腺癌有更深入全面的認(rèn)識(shí),篩選特異性的生物標(biāo)志物;(2)與臨床轉(zhuǎn)化緊密結(jié)合，乳腺癌的候選特異代謝性生物標(biāo)志物報(bào)道已有不少,但真正運(yùn)用到臨床診治上還有待進(jìn)一步探索和開發(fā)，并且代謝組學(xué)對(duì)許多內(nèi)外因素非常敏感，微小的差異可能影響代謝譜，迫切需要規(guī)范實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析技術(shù);(3)代謝物的濃度動(dòng)態(tài)變化跨度大，代謝物的組成非常復(fù)雜,且容易受到干擾,目前靠單一分析方法無法準(zhǔn)確測(cè)量整個(gè)代謝組群，因此檢測(cè)技術(shù)仍需不斷突破;(4)代謝組學(xué)分析產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，利用現(xiàn)有的代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有變化的代謝物進(jìn)行全面識(shí)別是困難的，已鑒定的代謝物的變化機(jī)制也難以解釋；(5)乳腺癌并非一個(gè)孤立的腫瘤,其代謝過程還受所處內(nèi)環(huán)境的影響,目前研究中所利用的組織樣本一般都獨(dú)立于腫瘤微環(huán)境體系,因此這也是進(jìn)一步研究中值得探索的問題。

由于高發(fā)病率和高死亡率，乳腺癌成為全球女性死亡的第二大原因。為了更好的了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程，通過結(jié)合不同的代謝分析技術(shù)，可以將人類乳腺癌組織的代謝組覆蓋最大化。腫瘤的病理生理過程涉及非常復(fù)雜的機(jī)制，其在不同發(fā)生階段會(huì)產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物，并且這些產(chǎn)物可能存在時(shí)空特異性，通過結(jié)合目前比較先進(jìn)的質(zhì)譜學(xué)分析技術(shù)，能夠更好地展示腫瘤不同發(fā)生過程的代謝產(chǎn)物。質(zhì)譜學(xué)的代謝組學(xué)目前已經(jīng)發(fā)展比較成熟，已經(jīng)可以通過高通量的方式分析數(shù)百個(gè)生物樣本，并可以此為基礎(chǔ)建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析、挖掘與闡釋，能夠更好地認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制。代謝組學(xué)產(chǎn)生了許多新的生物學(xué)上的見解，可用于在腫瘤生物學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)乳腺癌進(jìn)行篩查與分型，以確定新的預(yù)后和預(yù)測(cè)標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)未來治療干預(yù)的新靶點(diǎn)，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的到來，其進(jìn)步的范圍將繼續(xù)擴(kuò)大，為許多等待更有效治療方案的癌癥患者帶來新的希望。