UPLC法同時(shí)測(cè)定何首烏中2個(gè)蒽醌糖苷

母茂君，李 楊，李成功，劉 衡，譚 鵬，周 濃，張海珠，*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；3.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610045；4.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120）

何首烏又稱赤首烏、馬肝石等，始載于《開寶本草》，是蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根，主產(chǎn)于湖北、貴州、四川等地。根據(jù)炮制方法不同分為生首烏和制首烏，生首烏具有截瘧、潤(rùn)腸通便的功效；制首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血的功效〔1〕。民間常用作為補(bǔ)腎烏發(fā)、延年益壽之藥。何首烏中主要含蒽醌類、二苯乙烯苷類和磷脂類成分〔2〕?，F(xiàn)代研究表明何首烏中的結(jié)合性蒽醌，如大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷具有益智、抗衰老和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶作用〔3-4〕。目前有關(guān)何首烏藥理作用及機(jī)制研究的報(bào)道較多，但是有關(guān)何首烏中蒽醌糖苷定量方法的研究較少，阻礙了何首烏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升。

本研究基于超高效液相色譜法建立何首烏藥材中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷含量同時(shí)測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的何首烏藥材中的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行了定量檢測(cè)，考察其含量分布的差異性，以期為何首烏藥材的質(zhì)量評(píng)控提供一種新的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司，配備有二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower 2色譜工作站；XS-205電子天平，AL-204電子天平，METTLER TOLEDO公司；超聲儀，南京新辰生物科技有限公司，40 KHz。

1.2 試藥大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)23313-21-5，純度以98.45%計(jì)，由深圳菲斯化工有限公司提供）；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)131012，純度以98.41%計(jì)，由成都克洛瑪生物科技公司提供）。甲醇、磷酸為色譜純，美國(guó)Fisher公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材16批次何首烏藥材購(gòu)買于不同省份，粉碎，過四號(hào)篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以WatersBEHC18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）為分離柱，VanGuard Pre-Column（1.7μm，2.1mm×5mm）為保護(hù)柱；以甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相；流速為0.2 mL∕min；梯度洗脫條件為：0～5 min：55→63（A），5～9 min：63→70（A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫為30℃；理論塔板數(shù)按大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于7 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備以色譜級(jí)甲醇作溶劑，精密稱取大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，配制成濃度為66、48 μg∕mL的混合對(duì)照品溶液（先用0.5 mL二甲基亞砜溶解，再用甲醇定容至刻度）。

2.3 供試品溶液的制備取何首烏藥材粉末（過四號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 儀器精密度考察取混合對(duì)照品溶液，按上述含量測(cè)定方法連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷峰面積RSD為0.53%，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰面積RSD為1.15%，表明儀器的精密度良好。

2.5 線性關(guān)系考察取混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取對(duì)照品混合液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)得峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷一次進(jìn)樣量在0.033～0.198 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程和相關(guān)系數(shù)為Y=9.8×105X-1 462，r=0.999 5；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.024～0.144 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=6.4×105X-1 148，r=0.999 1。

2.6 重復(fù)性考察取同一批供試品（6號(hào)供試品）粉末0.20 g，共6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，每次2 μL，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果樣品中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值為0.42%，RSD為1.27%；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值為0.18%，RSD為1.86%；表明供試品含量測(cè)定重復(fù)性良好。

2.7 準(zhǔn)確度考察（加樣回收率試驗(yàn)）取錐形瓶6個(gè)，分別精密加入新配制的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液（66 μg∕mL）6.36 mL、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液（48 μg∕mL）3.75 mL，減壓回收溶劑至干，再精密稱取已知含量供試品（6號(hào)供試品粉末，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量為4.2 mg∕g，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖含量為1.8 mg∕g），各稱取約0.10 g，分別精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。進(jìn)樣測(cè)定，按下式計(jì)算回收率。

測(cè)定結(jié)果為6份供試品中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的平均加樣回收率分別為98.44%、95.37%，RSD分別為1.35%、2.41%，表明本方法具有較好的回收率，測(cè)定方法可靠。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性考察取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，間隔0、2、4、8、16、24 h測(cè)定1次，進(jìn)樣2 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的RSD為0.76%，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的RSD為0.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測(cè)定需要。

2.9 供試品含量測(cè)定取不同產(chǎn)地何首烏藥材粉末各0.20 g，按“2.3”項(xiàng)下制備樣品溶液，進(jìn)樣2 μL，記錄峰面積，計(jì)算樣品中的含量。見表1。對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

表1 不同產(chǎn)地何首烏藥材供試品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，%）

圖1 對(duì)照品溶液（A）與供試品溶液（B）的UPLC圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)混合對(duì)照品溶液采用DAD檢測(cè)器在200～410 nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描，結(jié)果顯示大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷在281 nm處具有最大吸收，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷在271 nm處具有最大吸收。實(shí)驗(yàn)過程中分別以乙腈-0.1%磷酸水溶液（30：70）、甲醇-0.1%磷酸水溶液（55：45）、甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相；流速為0.2 mL∕min；柱溫為25、30、35℃，分別進(jìn)行試驗(yàn)研究。綜合考慮供試品中雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰峰純度的干擾、基線噪音、出峰時(shí)間及色譜峰形的優(yōu)化，最終選擇上述梯度洗脫條件，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，在該色譜條件下，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷與雜質(zhì)峰分離效果良好，保留時(shí)間適中；通過二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品峰純度檢測(cè)，峰純度角度小于峰純度閾值，均為符合要求的純峰，峰純度檢測(cè)見圖2。

圖2 供試品中色譜峰純度圖

測(cè)定結(jié)果顯示，16批次不同產(chǎn)地的何首烏藥材中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量差異較大，從貴州遵義購(gòu)買的1批野生何首烏藥材（6號(hào)供試品）中含量最高達(dá)到0.42%，而從云南、貴州購(gòu)買的2批野生何首烏藥材（8、9號(hào)供試品）未檢測(cè)出大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷。另外從何首烏藥材中大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量來看，普遍在0.2%以下甚至未檢測(cè)出。或許這暗示可以用大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷作為指標(biāo)性成分來區(qū)分何首烏藥材品質(zhì)的優(yōu)劣。

由于近年來不斷出現(xiàn)服用何首烏導(dǎo)致肝損傷病例的報(bào)道〔5-6〕，引起社會(huì)的廣泛關(guān)注，藥學(xué)工作者對(duì)其肝損傷機(jī)制機(jī)理也作了大量研究〔7-11〕。目前對(duì)何首烏藥材的藥理作用和質(zhì)量控制研究大多集中在二苯乙烯苷類成分上，對(duì)何首烏中結(jié)合性蒽醌苷類定量檢測(cè)的研究甚少。如何更加科學(xué)地評(píng)控何首烏藥材的質(zhì)量對(duì)保障臨床安全用藥具有重要的意義。何首烏作為傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，亟須建立跟其補(bǔ)益功效相關(guān)的指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》通過間接法測(cè)定結(jié)合蒽醌的含量顯得比較繁瑣〔12〕，本實(shí)驗(yàn)首次建立了超高效液相色譜法同時(shí)直接測(cè)定何首烏藥材中2個(gè)結(jié)合性蒽醌糖苷含量的方法，該法簡(jiǎn)便、精確、快速，能在6 min內(nèi)快速完成2個(gè)成分的含量測(cè)定，為何首烏藥材的質(zhì)量控制提供了一個(gè)參考方法。