金沙江木生淡水絲孢菌資源調(diào)查

李文麗，沈洪葦，章艷玫，阮清雄，周期山，蘇鴻雁*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

木生淡水絲孢菌（lignicolous freshwater hyphomycetes）是一類生態(tài)復(fù)合群，主要寄生在纖維素含量較高的木質(zhì)基質(zhì)上，其生活史的完成需要依賴淡水環(huán)境〔1〕。木生淡水絲孢菌是水環(huán)境中重要的微生物組分，發(fā)揮著重要的生態(tài)功能〔2〕。在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中，木生淡水絲孢菌能將有機物分解成可被原生動物吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)和碳源，促進水體碳循環(huán)〔3〕。其次，淡水真菌能合成多種新型化合物，有報道證明一些具有活性的次生代謝產(chǎn)物，對腫瘤、細菌、真菌、線蟲等有顯著的殺傷作用，因此淡水真菌在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境治理等領(lǐng)域具有潛在的研究及應(yīng)用價值〔4〕。也有部分淡水真菌是淡水動植物的病原菌，能引起淡水動植物的真菌病〔4-7〕。

研究表明海拔對水生絲孢菌〔8〕、菌根菌〔9〕、溪流里的木生真菌〔10〕、土壤真菌〔11〕等微生物的群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性有影響。Geml等〔11〕研究了阿根廷安第斯山脈土壤真菌沿海拔梯度的變化并認為真菌群落的物種組成和海拔高度密切相關(guān)。Baerlocher等〔12〕對澳大利亞沉水葉片中的水生絲孢菌進行研究時發(fā)現(xiàn)真菌群落相似性和海拔梯度相關(guān)。Gómez-Hernández等〔13〕對沿海拔分布的外生菌根菌群落結(jié)構(gòu)進行了研究，結(jié)果表明物種豐富度最高的是在中高海拔段。Shearer等〔14〕對秘魯安第斯山水生子囊菌沿海拔梯度（218～3 870 m）分布的研究中，發(fā)現(xiàn)在低海拔（300 m以下）、中海拔（300～1 000 m）、高海拔（1 000 m以上）形成3個類群，中海拔水生子囊菌的多樣性最高，低海拔次之，高海拔最低。Bahram等〔15〕對伊朗北部森林中外生菌根菌研究表明，物種多樣性隨海拔高度增加而降低，認為這可能是由于隨著海拔升高植被多樣性降低的緣故。Rahbek〔16〕研究也表明水生真菌的豐富度最高是在中高海拔段。Shearer等〔14〕認為由于研究區(qū)域的局限，不同海拔物種多樣性不同與海拔、植被（宿主）是否相關(guān)還不是很清楚，物種多樣性在中高海拔段最高還不能下結(jié)論。

金沙江地處滇西北三江并流區(qū)，流域面積廣，海拔高差顯著，支流眾多，氣候濕熱，降水充沛，植被覆蓋率高。金沙江良好的氣候條件及多樣的植被類型造就了該區(qū)豐富的物種多樣性。淡水真菌作為水體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，目前尚未有金沙江淡水真菌方面的相關(guān)研究。本項目采集金沙江不同海拔、不同河段的腐木進行木生淡水真菌多樣性研究，了解該地區(qū)淡水真菌資源、多樣性特征及群落組成，為金沙江木生淡水真菌的保護與利用提供本底資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集將金沙江（石鼓鎮(zhèn)-白馬雪山段，海拔：1 814～3 034 m）分為10個采樣點，采集腐爛程度高（指掐木質(zhì)松軟為宜），直徑1～2 cm，長10～15 cm的沉水腐木。每個采樣點采集20根樣品，共采集200根腐木，用自封袋裝好后帶回實驗室，并記錄采樣地的地理信息、溫度以及水體pH。見表1。

表1 樣點地理信息

1.2 樣品培養(yǎng)根據(jù)采樣點的先后順序?qū)悠愤M行編號，準備20 cm×15 cm大小的不完全封閉塑料盒，用75%的酒精噴灑消毒，在盒底墊吸水紙，用無菌水浸濕，并放置2～3根塑料吸管，將樣品放在吸管上，避免腐木與濕紙發(fā)生黏連，蓋上蓋子，在盒蓋上標明采集地點、日期、采集人等相關(guān)信息。室溫培養(yǎng)1～2周后開始檢測樣品，檢測期間根據(jù)樣品干濕度，可適量加無菌水，保持樣本濕潤。

1.3 形態(tài)觀察保濕培養(yǎng)1周后，在GL-99BI連續(xù)變倍體視鏡下觀察菌落在自然基質(zhì)上的著生方式及外部形態(tài)，并用大頭針在目標菌株附近做好標記。用接種針將腐木上的菌株挑出，做成水封片后在OLYMPUS BX51生物顯微鏡下觀察并拍取能反映菌體形態(tài)、孢子梗形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等形態(tài)的照片并作相應(yīng)記錄。

1.4 培養(yǎng)基的配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯100 g（去皮），葡萄糖粉10 g，瓊脂條8.5g，去離子水加至500mL。

水-瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂條8.5 g，去離子水加至500 mL。

麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（MEA）：麥芽浸粉7.5 g，瓊脂條8.5 g，去離子水500 mL。

MEA斜面的配制：稱取麥芽浸粉7.5 g，瓊脂粉8.0g，加去離子水500mL煮沸，每支保種管浸注1.5mL，121℃高壓滅菌20 min取出，平置于超凈工作臺上，冷卻后即可制成斜面。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)高壓滅菌鍋121℃高溫高壓20 min，冷卻至50℃后加入氨芐青霉素（終濃度為100 ug∕mL）混勻，倒入平板凝固后方可使用。

1.5 菌種的分離純化觀察到目標菌株后，用無菌牙簽蘸取少量培養(yǎng)基，輕輕將分生孢子分離下來，采用劃線法，以便孢子分散在PDA培養(yǎng)基表面，并在培養(yǎng)皿上標明菌株編號及接種日期。室溫培養(yǎng)12～24 h，將萌發(fā)的孢子轉(zhuǎn)接到新的PDA或MEA培養(yǎng)基上，用封口膜封口并定期檢查菌落的生長情況。

1.6 菌種鑒定基于形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法對獲得的菌株分類鑒定，參考Seifert等〔17〕、Ellis〔18〕、任守才〔19〕、張凱〔20〕、張儀東〔21〕、姜于蘭〔22〕、馬建〔23〕、黃悅?cè)A〔24〕有關(guān)絲孢菌分類文獻，結(jié)合外形以及微觀形態(tài)（包括分生孢子梗，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，產(chǎn)孢方式，孢子的形狀、大小、顏色、分隔、真或假隔膜，有無膠質(zhì)鞘或附屬絲等特征）對菌株進行初步分類。同時，刮取已獲得純培養(yǎng)的菌株菌絲，提取基因組DNA，測序后，將序列提交到NCBI網(wǎng)站上進行比對，進一步確定物種的分類地位。

1.7 菌種保存從培養(yǎng)基中刮取少量新鮮菌絲轉(zhuǎn)接到MEA斜面上，室溫培養(yǎng)至菌絲覆蓋整個斜面后，放入4℃冰箱保存，所有操作均在無菌環(huán)境中進行。該方法在保存過程中易出現(xiàn)培養(yǎng)基水分喪失、菌體失活，因此每隔半年須重新轉(zhuǎn)接，只適合短期保存。

1.8 干保本制作在體視鏡下找到目標菌，將生長有子實體的木塊用小刀切割下來，切割面積約為3 cm×3 cm。將切割下來的小木塊放在信封紙上晾干，晾干后裝入信封中，并在封口上注明編號及保存日期，在陰涼干燥處進行長期保存。

1.9 數(shù)據(jù)分析淡水絲孢菌出現(xiàn)頻率（%）=（某個種出現(xiàn)次數(shù)∕樣品總數(shù)）×100%。

采用香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）分析金沙江淡水絲孢菌的多樣性〔25〕。香農(nóng)-維納指數(shù)為：

其中，H′是群落多樣性指數(shù)，Ni是第i種真菌的數(shù)量，N是所有真菌的數(shù)量，Pi是第i種真菌的數(shù)量占所有真菌數(shù)量的比例，S為所有真菌的種數(shù)。

2 實驗結(jié)果

檢測得到55株木生淡水絲孢菌，基于形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法對木生淡水絲孢菌進行鑒定，共鑒定出木生淡水絲孢菌23屬37種，出現(xiàn)頻率相對較高的屬為Minimelanolocus（4.5%），其次為Stachybotrys（2.5%）和Bactrodesmium（2.5%）。見表2。采用H′計算得出金沙江木生淡水絲孢菌多樣性指數(shù)是3.48，同時計算得出金沙江海拔1 800～1 900 m、1 900～2 000 m、2 000～3 000 m以及3 000 m以上的木生淡水絲孢菌多樣性指數(shù)依次為2.07、2.01、1.57、1.50。見表3。

表2 金沙江淡水絲孢菌屬級出現(xiàn)頻率

續(xù)表2

表3 各海拔段淡水絲孢菌多樣性分布

3 討論

滇西北地區(qū)是世界上寶貴的物種基因庫，此區(qū)氣候濕熱，降水充沛，植被類型多樣，具有良好的物候條件。金沙江地處滇西北三江并流地區(qū)，流域內(nèi)良好的氣候條件及多樣的植被類型孕育了該區(qū)豐富的物種資源。此次通過對金沙江（石鼓鎮(zhèn)-白馬雪山段，海拔：1 814～3 034 m）的200份腐木樣本進行檢測，共發(fā)現(xiàn)23屬37種，其中出現(xiàn)頻率最高的物種為Minimelanolocus（4.5%），其次為Stachybotrys（2.5%）和Bactrodesmium（2.5%），多樣性指數(shù)為3.48，表明金沙江淡水絲孢菌資源豐富且多樣性高，這與Shearer等〔26〕預(yù)測我國蘊含著豐富的淡水絲孢菌資源的結(jié)論一致。Shearer等〔14〕研究了低海拔（300 m以下）、中海拔（300～1 000 m）以及高海拔（1 000 m以上）的淡水真菌多樣性，得出中海拔段的淡水真菌多樣性最高，低海拔段次之，高海拔段最低的結(jié)論。本次研究對比1 800～1 900 m、1 900～2 000 m、2 000～3 000 m以及3 000 m以上各個高海拔段木生淡水絲孢菌豐度，發(fā)現(xiàn)隨著海拔梯度的升高，木生淡水絲孢菌的多樣性逐漸降低。由于樣品采集地的水溫及水pH并沒有隨海拔的升高而出現(xiàn)規(guī)律性變化，因此在本研究中溫度和pH沒有成為影響木生淡水絲孢菌多樣性分布格局的主要因素。高海拔段木生淡水絲孢菌多樣性逐漸降低的原因可能是：①隨著海拔的升高，植被的覆蓋率降低，落入水中的基質(zhì)減少，淡水絲孢菌缺乏合適的著生基質(zhì)；②高海拔地區(qū)的樹種為抵制嚴寒，表皮往往會形成一層蠟質(zhì)，不利于淡水絲孢菌的附著。