乳酸菌接種發(fā)酵泡菜工藝研究

周佳，龍思伊，仝靜雯，王超楠，馮靜，李秀文，田寶霞

（淮陰工學(xué)院，江蘇淮安223003）

泡菜歷史悠久，是利用乳酸菌發(fā)酵蔬菜制成的[1]，保留了蔬菜中的維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分[2,3]。泡菜制作中使用的香辛料，如生姜中的姜酮、姜醇、姜酚等，具有抗胃潰瘍、抗腫瘤、強(qiáng)心以及保肝利膽的作用[4]。泡菜中還含有微生物發(fā)酵過程中進(jìn)行自身代謝調(diào)節(jié)產(chǎn)生的有益中間代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、B族維生素、氨基酸、乙酰膽堿等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，泡菜在一定程度上能預(yù)防心血管疾病，主要是因為乳酸菌能分解膽鹽為解聚態(tài)，解聚態(tài)膽鹽和乳酸菌一起沉淀，使膽固醇含量降低[6]。王嬌等[7]對乳酸菌生理功能的研究結(jié)果表明乳酸菌具有誘導(dǎo)因子作用，能激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，而這些細(xì)胞具有殺腫瘤作用。

泡菜發(fā)酵分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵。自然發(fā)酵是利用蔬菜上本身附著的微生物進(jìn)行發(fā)酵，雖然可能產(chǎn)生特殊風(fēng)味但菌群不明，發(fā)酵風(fēng)險大、不徹底，易產(chǎn)生雜醇和高揮發(fā)酸，發(fā)酵結(jié)果不可控。人工發(fā)酵是指把微生物接種于蔬菜上進(jìn)行發(fā)酵，需要有專業(yè)的人員完成，我國在這一方面技術(shù)還不成熟。泡菜主要是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸制成的，常用的乳酸菌有腸膜明串珠菌及植物乳桿菌、短乳桿菌等，前者常用于發(fā)酵前期[8]。這些乳酸菌都是異養(yǎng)厭氧型，通常以乳酸為唯一或主要代謝產(chǎn)物，所以它們對酸性環(huán)境十分耐受。最適生長溫度一般為300～400℃，并且具有很強(qiáng)的抗鹽性。人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵相比，亞硝酸鹽含量低，總酸含量高，發(fā)酵速度快，其中接種植物乳桿菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽最少[9]。國內(nèi)外學(xué)者對泡菜的研究較多，這些研究多集中于泡菜發(fā)酵工藝、泡菜品質(zhì)影響因素以及不同泡菜制作模式的區(qū)別等方面[11-14]?；谌斯そ臃N發(fā)酵的諸多優(yōu)點，研究了不同食鹽添加量、糖添加量、發(fā)酵溫度及菌種等對乳酸菌接種發(fā)酵泡菜品質(zhì)的影響，并進(jìn)一步優(yōu)化了乳酸菌接種發(fā)酵泡菜的最佳工藝，從而提高泡菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

包菜，市售，選擇大小均勻、成熟度一致，脆嫩、不萎蔫，無腐爛、無異味、無機(jī)械損傷的新鮮包菜。冰糖、鹽、辣椒等輔料，購于當(dāng)?shù)夭耸袌?。使用的乳酸菌株分別為本實驗室保存的鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。使用的試劑包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、葡萄糖、吐溫-80、瓊脂、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸錳、氫氧化鈉、鹽酸、亞鐵氰化鉀和鹽酸奈乙二胺。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母膏5.00 g、檸檬酸二銨2.00 g、葡萄糖20.00 g、吐溫-80 1.00 mL、乙酸鈉5.00 g、磷酸氫二鉀2.00 g、MgS04·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、瓊脂 20 g，pH 6.2～6.4。用蒸餾水定容至1000 mL，121℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，101-2A，滬鑫電爐烘箱廠；電子天平，F(xiàn)A1104，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；分光光度計，751型，上海菁華科技儀器有限公司；冷凍離心機(jī)，5804R，Eppendorf；恒溫水浴鍋，HH-4，金壇市杰瑞爾電器有限公司；超凈工作臺，SW-CJ-2F，蘇州凈化設(shè)備有限公司；多功能搖床，HYG-C型，蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，DH-6000AB，金壇市城東科輝儀器廠；恒溫磁力攪拌器，85-2，常州國華電器有限公司；雷磁pH計，pHS-3E，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌器，mlS-3780，三洋電機(jī)株式會社。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

將實驗室保藏的菌種鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌分別接種于MRS固體培養(yǎng)基，在(37±1)℃下培養(yǎng)48～72 h。挑取MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落接種到至MRS液體培養(yǎng)基上，置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行活化逐級擴(kuò)大至發(fā)酵要求。

1.3.2 制作工藝流程

泡菜發(fā)酵原料有包菜50 g、水200 mL、鹽、冰糖若干、姜1 g、辣椒1 g、花椒少許。選用肉質(zhì)細(xì)嫩、表面無破損、無病蟲害的新鮮包菜。將包菜切成小塊，然后用清水洗凈、晾干；泡菜壇先加入適量白酒，然后倒置一段時間，倒掉白酒；稱取包菜裝入泡菜壇中加入適量涼開水[15]。然后加入一定量的食鹽、蔗糖等，接入乳酸菌菌種，選擇合適的溫度，密封發(fā)酵（還可以進(jìn)行液封，保持無氧環(huán)境）。泡菜中加入的香辛料，不僅能調(diào)味還能殺菌防腐[16]。制作工藝流程如圖1所示。

圖1 泡菜制作工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of pickled vegetables production

1.4 測定指標(biāo)及方法

由10名專業(yè)人員組成感官評定小組，對泡菜的色澤、香氣、滋味和質(zhì)地這4個指標(biāo)進(jìn)行評價，滿分10分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[17,18]。

表1 感官評價指標(biāo)及評分權(quán)重Table 1 Sensory evaluation index and score weight

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵與人工接種發(fā)酵比較

泡菜在30℃下分別進(jìn)行自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵，發(fā)酵5 d后，分別測其亞硝酸鹽含量、pH值和總酸，結(jié)果見表2。從表中可以看出，發(fā)酵5 d后人工接種發(fā)酵的亞硝酸鹽含量明顯低于自然發(fā)酵，并且pH值也低于自然發(fā)酵。可見人工發(fā)酵泡菜在亞硝酸鹽和總酸指標(biāo)上明顯優(yōu)于自然發(fā)酵。

表2 自然發(fā)酵與接種發(fā)酵化學(xué)成分比較Table 2 Comparison of chemical constituents between natural fermentation and inoculation fermentation

2.2 食鹽添加量對泡菜發(fā)酵的影響

分別添加2%、3%、4%、5%、6%的食鹽，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的混合接種量為3%、接種比例為1:1，蔗糖添加量為2%，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，測定泡菜的總酸和亞硝酸鹽含量，研究不同的食鹽添加量對泡菜產(chǎn)酸量及pH的影響，結(jié)果見圖2，綜合評分見表3。如圖2所示，pH值隨鹽濃度的增加而增加，總酸隨鹽濃度的增加而降低。鹽濃度為2%時，pH值過低，總酸含量也很高，泡菜的口感過酸。由表3可知，不同的食鹽添加量泡菜的感官相差不大，食鹽添加量為3%時泡菜的感觀評分最高，滋味清脆，香氣濃郁，質(zhì)地不綿軟，但此食鹽濃度過低，泡菜不利于貯藏，保藏期較短，易發(fā)生腐敗變質(zhì)，其次是2%和4%的食鹽添加量，評分均為6.6分；從長遠(yuǎn)角度來說應(yīng)選擇較高的食鹽濃度（表3）。綜上分析，泡菜鹽的添加量為4%時最佳。

圖2 不同食鹽添加量對總酸和pH值的影響Fig.2 Effects of different salt additions on total acid and pH

表3 不同食鹽添加量下泡菜品質(zhì)的綜合評分表Table 3 Comprehensive scoring table for quality of pickled vegetables with different salt additions

2.3 蔗糖添加量對泡菜發(fā)酵的影響

分別添加0%、1%、2%、3%、4%的蔗糖，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的混合接種量為3%，接種比例為1:1，食鹽添加量為4%，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，測定泡菜的總酸和亞硝酸鹽含量，研究蔗糖濃度對泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和亞硝酸鹽含量的影響，結(jié)果見圖3（見下頁），綜合評分見表4。如圖3所示，總酸的含量隨著蔗糖含量的增加而增加，pH值隨著蔗糖含量的增加而下降。泡菜品質(zhì)綜合評分顯示，當(dāng)蔗糖的添加量為2%時，泡菜色澤明亮，口感較佳，并且聞起來香氣濃郁。添加蔗糖后，整體上對泡菜的品質(zhì)影響不大，但當(dāng)蔗糖添加量過高時，太多糖分會降低泡菜的酸爽感，同時還增加了成本，且pH值也較低，得不到優(yōu)良的口感（表4）。所以根據(jù)感官，總酸和pH值的結(jié)果，綜上分析，得出蔗糖的添加量為2%時，產(chǎn)品最佳。

圖3 不同蔗糖添加量對總酸和pH值的影響Fig.3 Effects of different sucrose additions on total acid and pH

表4 不同糖添加量下泡菜品質(zhì)的綜合評分表Table 4 Comprehensive scoring Table for quality of pickled vegetables with different sugar additions

2.4 溫度對泡菜發(fā)酵的影響

食鹽添加量為4%，蔗糖添加量為2%，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的混合接種量為3%，接種比例為1:1，溫度分別為23、30、37℃的恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d，測定泡菜的總酸和亞硝酸鹽含量，研究發(fā)酵溫度對泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和亞硝酸鹽含量的影響，綜合評分見表5。如表5所示，泡菜的口感隨著溫度的升高而逐漸升高，30℃左右達(dá)到最佳口感。溫度是影響泡菜發(fā)酵的因素之一，溫度過低，乳酸菌的增長緩慢，泡菜生產(chǎn)率大大降低，并且相同時間發(fā)酵出的泡菜口感不好，質(zhì)地較軟；溫度過高，乳酸菌的生理活性受到抑制，發(fā)酵出的泡菜色澤較暗淡，發(fā)生褐變。由表5可知，發(fā)酵溫度控制在30℃左右時，泡菜的風(fēng)味較好，無褐變。

表5 不同溫度條件下泡菜品質(zhì)的綜合評分表Table 5 Comprehensive quality scoring table for pickled vegetables at different temperatures

2.5 接種量對泡菜接種發(fā)酵的影響

分別接種1%、2%、3%、4%、5%的乳酸菌，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的混合接種比例為1:1，食鹽添加量為4%，蔗糖添加量為2%，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，測定泡菜的總酸和亞硝酸鹽含量，研究乳酸菌菌種接種量對泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸和亞硝酸鹽含量的影響，結(jié)果見圖4，綜合評分見表6。如圖4所示，接種量對泡菜的品質(zhì)有較大影響。接種量較小，導(dǎo)致發(fā)酵時間長，總酸低，pH值高，從而使產(chǎn)品的生產(chǎn)率低。接種量過大時，乳酸菌生長速度過快，會使產(chǎn)物乳酸增加的同時，增加總酸含量，降低pH值，使口感變差，同時導(dǎo)致其他次級代謝廢物產(chǎn)量也增加。如表6所示，分別對接種量為1%、2%、3%、4%、5%的泡菜產(chǎn)品進(jìn)行感官評定，綜合分析可知，當(dāng)接種量為3%時，發(fā)酵所得的泡菜品質(zhì)最好。

圖4 不同接種量對總酸和pH值的影響Fig.4 Effects of different inoculation dosage on total acid and pH

表6 不同接種量下泡菜品質(zhì)的綜合評分表Table 6 Comprehensive quality scoring table for pickled vegetables with different inoculation quantities

2.6 泡菜亞硝酸鹽含量

亞硝酸鹽含量是評測泡菜質(zhì)量的重要指標(biāo)。不同鹽濃度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響見圖5。由圖可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的升高泡菜亞硝酸鹽的含量先下降后上升。在鹽濃度為4%時泡菜亞硝酸鹽的含量最低，并且此時的感官得分也較高。在鹽濃度為2%時，因為存在著雜菌的生長，使硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}的量增加。在鹽濃度為6%時，由于鹽濃度過高，乳酸菌的生長受到了抑制，對亞硝酸鹽的降解速率下降，導(dǎo)致亞硝酸鹽含量較高。綜合感官評分，在鹽濃度為4%時，泡菜的亞硝酸鹽含量低，此時泡菜口感較好。

不同蔗糖濃度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響見圖6，由圖可知，總體上不同的蔗糖濃度對泡菜的亞硝酸鹽含量的影響并不大。但蔗糖濃度為2%時亞硝酸含量雖然和蔗糖濃度為3%時的亞硝酸鹽含量相差不大，但感官評分要更優(yōu)。也就是說，添加2%的蔗糖不僅亞硝酸鹽含量較低，更有著較優(yōu)的口感。

不同發(fā)酵溫度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響測試結(jié)果顯示，溫度對泡菜中亞硝酸鹽的含量影響較小，但溫度較高時乳酸菌的生長受到抑制，還原亞硝酸鹽的能力大大降低，使得亞硝酸量較高（表7）。溫度較低時，乳酸菌的活性也會受到一定程度的抑制，只有乳酸菌處于其最適溫度時，才適宜發(fā)酵泡菜。

本研究還調(diào)查了30℃發(fā)酵溫度下鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌菌種接種量配比下對泡菜亞硝酸鹽含量的影響（表7）。單獨接種鼠李糖乳桿菌時，泡菜的亞硝酸鹽含量較低，但此時泡菜的口感并不太好；單獨接種植物乳桿菌時，泡菜的口感較好，但是亞硝酸鹽含量又較高。當(dāng)兩種菌種混合使用時，泡菜的亞硝酸鹽含量較低且有很好的口感。

圖5 不同鹽濃度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.5 Effects of different salt concentrations on nitrite content in pickled vegetables

圖6 不同蔗糖濃度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 Effect of sucrose concentration on nitrite content in pickled vegetables

表7 溫度及不同菌種配比對泡菜亞硝酸鹽含量的影響Table 7 Effect of temperature and different bacteria ratio on nitrite content in pickled vegetables

3 結(jié)論

綜上所述，確定了乳酸菌接種發(fā)酵泡菜的最佳工藝：食鹽添加量為4%，接種量為3%，蔗糖添加量為2%，發(fā)酵溫度為30℃，且經(jīng)過人工接種發(fā)酵的泡菜口感較佳。并且接種發(fā)酵的時間較短，可以大批量的生產(chǎn)，所得的產(chǎn)品一致性相似，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于自然發(fā)酵。通過人工接種，可以使乳酸菌成為優(yōu)勢菌種，避免了雜菌的生長。乳酸菌在發(fā)酵過程中快速生長并且產(chǎn)生乳酸，降低泡菜的pH值，使泡菜中的蛋白質(zhì)分解為游離的氨基酸，與鈣等離子結(jié)合形成有生物活性的氨基酸鈣，具有很高的營養(yǎng)價值。