高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測綠茶中的非法添加劑孔雀石綠

劉超，景贊，鄒沫君，黃志勇，馮慧

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川樂山614000）

綠茶是我國傳統(tǒng)消費(fèi)的具有文化底蘊(yùn)的特色農(nóng)產(chǎn)品之一[1]，綠茶中不僅富含氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)元素，而且含有茶多酚、茶色素、茶多糖等功能性成分[2]，但綠茶儲存期較短，價格隨著季節(jié)的波動也較大。

孔雀石綠具有很好的穩(wěn)定性，通常作為一種工業(yè)合成染料用于絲綢、紙張和皮革的制造，然而，目前有些不法商販常在過期的綠茶中使用，以增強(qiáng)穩(wěn)定性，提高綠茶賣相。據(jù)報(bào)道，孔雀石綠具有高毒素、高殘留、致癌、致畸、致突變等副作用，被人體吸收后，積累到一定程度，就可能引發(fā)各種疾病，如血壓高、心率快、厭食、失眠、肝功能異常等。國內(nèi)關(guān)于孔雀石綠的報(bào)道較多，如馬宏飛[3]等研究了茶葉渣作為吸附劑，對孔雀石綠的吸附性能；王艷[4]等研究了綠茶微粉對染料亞甲基藍(lán)和孔雀石綠的吸附。這些報(bào)道多為對孔雀石綠吸附性能的研究，對綠茶中孔雀石綠檢測方法的研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)建立了液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法檢測綠茶中的孔雀石綠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Chemical提供。PSA，40～60 μm，Dikma提供。C18 粉末，40～50 μm，WELTECH（WUHAN）CO.,LTD提供。乙酸銨，有機(jī)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供。無水硫酸鎂，分析純，成都市科龍化工試劑廠提供，CAS：7487-8362。

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，北京曼哈格生物科技有限公司提供，CAS：2437-29-8，純度 99.1%。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18（150 mm×3.9 mm）。流動相A，乙腈；B，含0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸銨。流速，0.4 mL/min。進(jìn)樣體積，10 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.3 質(zhì)譜條件

DGU20A-API3200質(zhì)譜儀，ESI正離子模式，離子源參數(shù)見表2。掃描模式為多反應(yīng)檢測（MRM），具體參數(shù)見表3。

表2 離子源參數(shù)Table 2 Ion source parameters

表3 多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 3 Multi-reaction monitoring parameters

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

精密稱取10 mg孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)物至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液配置成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

準(zhǔn)確吸取0.1 mL的儲備液至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液配置成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取空白樣品0.5 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入 5、10、20、25、50、75 μL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和 10 mL乙腈，渦旋60 s后，振蕩提取5 min，超聲提取10 min（功率700 W），期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，再加入10 mL乙腈，重復(fù)上述過程，上清液合并轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中，用乙腈定容至刻度。稱取 100 mgPSA（40～70 μm）、50 mg無水硫酸鎂、200 mg C18粉末置于10 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取1.5 mL上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以8000 r/min離心5 min，孔雀石綠濃度范圍為2、4、8、10、20、30 ng/mL。 取 10 L 標(biāo) 準(zhǔn) 點(diǎn) 濃 度 注 入LC-MS/MS中，測定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并列出線性方程及線性范圍。

1.5 樣品制備

提?。壕芊Q取試樣0.5 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋60 s后，振蕩提取5 min，超聲提取10 min（功率700 W），期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，再加入10 mL乙腈，重復(fù)上述過程，上清液合并轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

凈化：稱取 100 mgPSA（40～70 μm）、50 mg無水硫酸鎂、200 mg C18粉末置于10 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取1.5 mL上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以8000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm的有機(jī)濾膜，備用。

1.6 檢出限與定量限

精密稱取空白樣品，空白溶液的制備方法同1.6樣品的制備方法。用空白樣品溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N），根據(jù)色譜圖測得信噪比，計(jì)算方法檢出限和定量限。

1.7 方法準(zhǔn)確性及重復(fù)性

低濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.5 g空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配置成4 ng/mL的質(zhì)控樣品。

中濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.5 g空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配置成10 ng/mL的質(zhì)控樣品。

高濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.5 g空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配置成20 ng/mL的質(zhì)控樣品。

1.8 方法精密度

稱取3份0.5 g空白樣品于3個50 mL聚四氟乙烯離心管中，分別在每個離心管中加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10、20、50 μL，然后按樣品制備方法操作，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，孔雀石綠在2～30 ng/mL濃度范圍內(nèi)，R2值為0.8978，可見，孔雀石綠在該濃度范圍內(nèi)線性良好，因此選取2～30 ng/mL為本試驗(yàn)的線性范圍。

2.2 專屬性

目標(biāo)化合物出峰處無干擾，一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖清晰可見，圖2、3說明該方法專屬性強(qiáng)。

圖1 孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of malachite green

圖2 孔雀石綠一級質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of malachite green

圖3 孔雀石綠二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS2 spectra of malachite green

2.3 檢出限和定量限

采用空白樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法測定[5-8]，孔雀石綠的方法的檢出限為1.77 μg/kg，定量限為5.89 μg/kg。

2.4 方法的準(zhǔn)確性及重復(fù)性

采用空白樣品加標(biāo)準(zhǔn)回收法測定[5,7]，取濃度分別為4、10、20 ng/mL的質(zhì)控（QC）樣品 3份，經(jīng)前處理進(jìn)樣分析，每種濃度平行進(jìn)樣6次，測得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度，除以理論加入濃度，獲得方法回收率，即準(zhǔn)確度結(jié)果。測得孔雀石綠的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。從表1我們可以看出，孔雀石綠在高、中、低三個水平回收率均為84.2%～93.1%，重復(fù)性RSD＜5%。這表明方法準(zhǔn)確性及重復(fù)性良好。

圖4 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Chromatogram of malachite green

表1 不同質(zhì)量濃度下的孔雀石綠回收率結(jié)果（n=6）Table 1 Recoveries of malachite green at different concentration levels（n=6）

2.5 方法的精密度

表2 方法精密度測定結(jié)果Table 2 Method Precision determination results （n=6）

取濃度為 4、8、20 ng/mL的質(zhì)控（QC）樣品 1份連續(xù)測定6次。測得孔雀石綠的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。由表2可以看出，孔雀石綠精密度均＜3%，表明儀器精密度良好[5,6]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)針對綠茶中孔雀石綠建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度等指標(biāo)。結(jié)果顯示：該方法在2～30 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；方法檢出限為 1.77 μg/kg；添加濃度在 4、10、20 ng/mL 三個水平條件下的平均回收率在84.2%～93.1%之間；孔雀石綠重復(fù)性＜5%，精密度＜3%。該方法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于綠茶中孔雀石綠的測定。