生物標(biāo)志物在子宮頸癌篩查中的應(yīng)用進(jìn)展

徐書航 化定超 王新宇

隨著子宮頸癌篩查的普及和癌前病變的處理進(jìn)一步規(guī)范，子宮頸癌的發(fā)生率和死亡率大大降低，美國癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，2017年全美地區(qū)子宮頸癌新發(fā)病例13 240例，死亡人數(shù)4 170例[1]。目前子宮頸癌篩查主要依靠宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查和高危人乳頭瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）檢測(cè)，然而宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查靈敏度較低，僅60%左右，HR-HPV檢測(cè)雖有較好的靈敏度，但特異度較低。兩種篩查方式的不足易導(dǎo)致漏診或部分患者的過度治療。即使在發(fā)達(dá)國家，依靠目前的篩查手段仍不能達(dá)到完全消滅子宮頸癌的目的，仍需探索更有效的技術(shù)來優(yōu)化篩查。

研究發(fā)現(xiàn)，HR-HPV感染宿主細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生一系列分子表達(dá)和功能的改變，繼而發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。因此，人們?cè)O(shè)想通過對(duì)這些分子變化的檢測(cè)來幫助篩查子宮頸癌，從而更有效地提高癌前病變的檢出率，避免不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。隨著研究的深入，已發(fā)現(xiàn)有一些生物標(biāo)志物與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。本文就目前的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 P16INK4A蛋白

P16蛋白屬于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI），由染色體9p21上CDKN2A基因編碼。P16通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，CDK4）對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[2]。在子宮頸癌病變過程中，HPV感染宿主細(xì)胞后整合至宿主細(xì)胞DNA導(dǎo)致病毒癌基因E6和E7的持續(xù)高表達(dá)，繼而使P16蛋白呈現(xiàn)過度表達(dá)的狀態(tài)。大量研究證明，P16的陽性率隨子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）級(jí)別的增高而增高，且與CIN進(jìn)展的危險(xiǎn)性相關(guān)[3]，提示P16蛋白作為生物標(biāo)記物分流CIN的可能性。

美國病理學(xué)會(huì)（CAP）和美國陰道鏡與宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）在2012年共同發(fā)布的下生殖道鱗狀上皮病變術(shù)語（LAST）中，建議將P16免疫組化染色用于CIN2的分層管理，P16陽性的處理同CIN3，陰性的可以隨訪，且當(dāng)P16陽性有連續(xù)大塊狀深棕色染色時(shí)，提示高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）可能性大[4]。Clinton 等[5]通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用LAST指南后，P16的使用率從2.8%提高到6.2%，HSIL陽性預(yù)測(cè)值從48%提高到76%。目前普遍認(rèn)為P16聯(lián)合HE染色能提高病理醫(yī)師診斷CIN2+的一致性[2]。然而，Pacchiarotti等[6]研究認(rèn)為P16對(duì)組織學(xué)診斷的重復(fù)性幾乎不產(chǎn)生影響。

此外，HPV陽性且P16陽性女性需要立即轉(zhuǎn)診陰道鏡，若陰道鏡檢查為陰性，應(yīng)每年隨訪；而HPV陽性但P16陰性女性可以不用行陰道鏡檢查，2～3年隨訪一次。針對(duì)HPV陰性但組織學(xué)診斷為CIN2～3的女性，若同時(shí)P16陰性，HSIL的診斷應(yīng)更為慎重[7]。Pabuccu等[8]通過研究認(rèn)為P16或許能夠作為分流非典型鱗狀上皮-不除外高度病變（atypical squamous cell cannot ex－clude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASCH）的一個(gè)有效手段。

然而在P16的實(shí)際臨床應(yīng)用中，還存在著一些問題。盡管大多數(shù)P16染色結(jié)果是明確的陽性或者陰性，仍有一部分結(jié)果是模棱兩可的，即僅滿足部分陽性的條件。這些模棱兩可的P16免疫反應(yīng)結(jié)果是否能作為感染致癌性HPV或判斷病灶進(jìn)展危險(xiǎn)性的依據(jù)仍有待研究。Liu等[9]研究認(rèn)為在預(yù)測(cè)致癌性HPV感染和HSIL的發(fā)生上，模棱兩可的P16結(jié)果弱于陽性結(jié)果，但比陰性結(jié)果強(qiáng)。Clark等[10]通過對(duì)262例女性的宮頸活檢結(jié)果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中有50例過度診斷為HSIL，原因可能是當(dāng)P16染色圖案為非塊狀時(shí)，將這樣的病例歸為HSIL，或?qū)16免疫組化法應(yīng)用于病理診斷為LSIL的女性，提示除了對(duì)結(jié)果判讀模糊不定外，可能還存在著P16過度使用的問題。為了更準(zhǔn)確有效地應(yīng)用P16，需要對(duì)P16結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即能對(duì)染色結(jié)果模糊不定的情況做出準(zhǔn)確的判斷，并且需要對(duì)LAST指南進(jìn)行相應(yīng)的補(bǔ)充，避免因?yàn)榕袛嗍д`導(dǎo)致錯(cuò)診或漏診。

2 P16/ki-67

抗原Ki-67是一種核蛋白，它在除了G0以外的細(xì)胞周期中均有表達(dá)。在正常生理情況下，ki-67在子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞基層的表達(dá)是有限的，ki-67的過表達(dá)意味著細(xì)胞處于增殖期。P16/ki67在正常子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞中互相拮抗，兩者共表達(dá)意味著細(xì)胞周期發(fā)生異常[11]。P16/Ki-67雙染細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CIN2+和巴氏涂片檢查相比有更高的靈敏度，與HPV檢查相比有更高的特異度[12]，提示其作為CIN2+篩查手段的可能性。

研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸細(xì)胞學(xué)異常人群中，P16/ki-67雙染細(xì)胞學(xué)檢查與HPV DNA檢測(cè)相比有更好的分流能力[13]，且費(fèi)用效能比更高[14]。而雙染細(xì)胞學(xué)與巴氏細(xì)胞學(xué)相比分流HPV陽性女性的特異度稍低，但靈敏度更高[15]。

雖然P16/ki-67雙染檢查能顯著提高診斷準(zhǔn)確性，然而在低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）和意義不明確的非典型鱗狀上皮（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）人群中進(jìn)行危險(xiǎn)分層的結(jié)果卻不盡如人意，尤其是在長期的臨床觀察過程中[13]。Ziemke等[16]推測(cè)可能與生物學(xué)因素有關(guān)，如年齡、閾值、重復(fù)性等，于是對(duì)1 141例女性在宮頸細(xì)胞學(xué)檢查時(shí)同時(shí)行P16/ki-67免疫組化染色（IHC），通過平均19個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn)，＜30歲的女性檢測(cè)出CIN2/HSIL的特異度小于＞30歲的女性；以10個(gè)P16/ki-67標(biāo)記細(xì)胞作為陽性標(biāo)準(zhǔn)比1個(gè)有更高的特異度；有28.4%的結(jié)果與第一次試驗(yàn)結(jié)果不相符。提示P16/ki-67要進(jìn)行有效應(yīng)用還需要在具體檢測(cè)方法上加以規(guī)范。

3 DNA甲基化標(biāo)記物

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基加到胞嘧啶的5號(hào)碳原子上。大多數(shù)的甲基化發(fā)生在CpG島二核苷酸，常位于啟動(dòng)子區(qū)域。抑癌基因（tumor suppressor genes，TSG）啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個(gè)重要機(jī)制[17]。

目前已有大量待測(cè)基因甲基化研究，但是準(zhǔn)確度不夠理想。聯(lián)合多種甲基化生物標(biāo)志物，從而達(dá)到較高的靈敏度和特異度是目前的研究趨勢(shì)。此外，甲基化標(biāo)志物檢測(cè)能夠提供客觀、非形態(tài)學(xué)的結(jié)果，能夠采用自我采樣樣本進(jìn)行檢測(cè)，聯(lián)合現(xiàn)有篩查方法能夠大大提高篩查效率，未來仍需要大樣本前瞻性臨床試驗(yàn)來對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.1 配對(duì)盒基因 1（PAX1） Kan等[18]研究結(jié)果顯示PAX1基因甲基化水平檢測(cè)CIN3+病灶的靈敏度和特異度分別達(dá)到了86%和85%，聯(lián)合巴氏涂片檢查靈敏度和特異度為89%和83%，不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診能減少至少60%。Li等[19]和Wang[20]分別比較了HC2 HPV檢測(cè)和MS-HRM法檢測(cè)PAX1基因甲基化在ASCUS和ASC-H中分流出CIN2+的能力，結(jié)果顯示后者檢測(cè)能力更強(qiáng)。此外，Nikolaidis等[21]對(duì)7項(xiàng)研究行Meta分析顯示，PAX1基因的甲基化檢測(cè)更高級(jí)別宮頸病變的特異度比HPV DNA檢測(cè)更高。

3.2 細(xì)胞黏附分子1（CADM1）和T淋巴細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白（MAL） Verhoef等[22]對(duì)364例HPV陽性女性宮頸刮片進(jìn)行了RCT研究，結(jié)果顯示雙標(biāo)志物CADM1/MAL甲基化分流CIN2+的能力與細(xì)胞學(xué)檢查相似，甲基化水平隨著病灶嚴(yán)重程度的增加而增加，且兩者聯(lián)合能提高靈敏度，雖然特異度降低，但53.6%的陰道鏡檢查率仍在接受范圍內(nèi)。已有研究認(rèn)為宮頸刮片中CADM1/MAL基因甲基化水平還和高危HPV的持續(xù)感染相關(guān)，高危HPV感染持續(xù)＞5年的高級(jí)別CIN與感染持續(xù)＜5年的相比，明顯有更高的CADM1/MAL基因甲基化水平。提示雙標(biāo)志物檢測(cè)能夠分流出長期存在的更晚期的高級(jí)別CIN病灶。van Baars等[23]進(jìn)一步研究了在多種HPV持續(xù)感染或多種級(jí)別病灶同時(shí)存在的宮頸中CADM1/MAL基因甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其是病灶特異性的，且宮頸刮片中甲基化水平往往代表著最差病灶的水平。

3.3 雙標(biāo)志物MAL/miR-124-2 雙標(biāo)記物MAL/miR-124-2的檢測(cè)能夠通過自采樣樣本進(jìn)行，但其靈敏度同細(xì)胞學(xué)檢測(cè)相似，僅僅依靠前者進(jìn)行分流也會(huì)導(dǎo)致不必要的陰道鏡檢查，故Verhoef等[24]希望通過研究提高M(jìn)AL/miR-124-2甲基化分析的特異度。通過對(duì)1 019例自采樣為高危HPV陽性女性的RCT臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，MAL/miR-124-2甲基化分析（閾值-80）或聯(lián)合HPV16/18基因型檢測(cè)能達(dá)到比較高的CIN3+檢出靈敏度和特異度。

4 HPV L1蛋白

HPV屬于乳頭瘤病毒科,由DNA核心和蛋白衣殼組成，而衣殼由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成。研究表明，HPV-L1陰性提示癌前病變可能性大，HPV-L1陽性提示一過性感染可能性大，且HPV L1隨著CIN級(jí)別增高而減少，在子宮頸癌中呈陰性[25]。Lee等[26]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HPVL1陽性但組織學(xué)CIN3+的病例可能是多種HPV感染導(dǎo)致的。此外，Mehlhorn等[27]研究發(fā)現(xiàn)HPV特異性免疫能力與LSIL的臨床緩解有顯著關(guān)聯(lián)，L1抗原和HPV16-L1抗體同時(shí)陽性的女性，發(fā)展為CIN3的危險(xiǎn)性很低（5.8%）。利用HPV L1蛋白與CIN的關(guān)系，后續(xù)需要進(jìn)一步研究其在子宮頸癌篩查中的效用。

5 microRNAs

近年來已有研究表明miRNA在子宮頸癌及癌前病變組織中呈現(xiàn)或上調(diào)或下調(diào)的現(xiàn)象，提示其作為子宮頸癌早期篩查標(biāo)志物的可能性[28]。其中，miR-29a和miR-21分別是上調(diào)及下調(diào)最頻繁的[29]。

Kong等[30]研究發(fā)現(xiàn)hsa-mir-92a血漿水平隨著宮頸病變程度增高而顯著升高，對(duì)子宮頸癌及癌前病變?cè)\斷的靈敏度和特異度達(dá)到69.6%和80.4%，AUC為0.83。另有學(xué)者對(duì) 4 種 miRNAs（miR-9，miR-10a，miR-20a和miR-196a）進(jìn)行研究得到類似的結(jié)論，且血漿miR-196a水平與CIN級(jí)別和子宮頸癌的大小，淋巴轉(zhuǎn)移，F(xiàn)IGO分期和分級(jí)有關(guān)，水平較高的患者總體生存率較低，提示miR-196a可能是一個(gè)早期檢測(cè)和預(yù)后判斷的生物標(biāo)記物[31-32]。

在HPV陽性女性宮頸脫落細(xì)胞中，Tian等[33]發(fā)現(xiàn)與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查相比，單獨(dú)的miR-424、miR-375，以及miR-424/miR-375/miR-218多標(biāo)記物聯(lián)合篩查高級(jí)別CIN的方式更佳。此外，Zhu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變程度上升，MiR-21-5p上升、miR-34a下降，區(qū)分LSIL和HSIL的能力與HPV檢測(cè)相比更具有特異性。Coimbra等[35]認(rèn)為ΔNp63 mRNA和miR-203是有效的子宮頸癌篩查標(biāo)志物，且兩者間可能存在某種間接通路。

綜上，miRNAs能夠在血漿水平、子宮頸脫落細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)miRNAs作用機(jī)制的研究有助于對(duì)子宮頸癌病變的理解，提高對(duì)HPV陽性女性的分流效能。

6 細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）

細(xì)胞角蛋白屬于細(xì)胞質(zhì)骨架蛋白中間絲的一種，上皮組織惡變后表達(dá)的細(xì)胞角蛋白與正常組織基本相同，因此細(xì)胞角蛋白被廣泛用于腫瘤的診斷。子宮頸鱗癌表達(dá) CK5、CK6、CK7、CK8、CK13、CK15、CK17、CK18、CK19。

在子宮頸癌中，CIN2-3從鱗柱交界部（squamocolumnar junction，SCJ）細(xì)胞中形成，而 CK7 IHC 能夠分辨出SCJ[36]。Mills等[36]在四價(jià)HPV疫苗臨床試驗(yàn)安慰劑組的CIN1女性中進(jìn)行CK7 IHC，結(jié)果分為陰性，斑駁的，有層次的，或全厚的圖案。結(jié)果顯示全厚的CK7染色與CIN2+的進(jìn)展有最高的相關(guān)性。Paquette等[37]則將CK7 IHC結(jié)果分為陽性（彌漫性的）和陰性，結(jié)果顯示陽性CK7的LSIL更易發(fā)展為HSIL。然而由于危險(xiǎn)性增加幅度低，差異性小和陰道鏡取材的限制，CK7的臨床應(yīng)用仍有待商榷。

Escobar-Hoyos等[38]研究證實(shí)從正常宮頸組織，LSIL，HSIL至宮頸癌細(xì)胞中，角蛋白17的表達(dá)上升，而角蛋白4的表達(dá)下降。角蛋白17的表達(dá)可以從LSIL患者與健康個(gè)體中分流出HSIL與鱗狀細(xì)胞癌患者，具有較高的靈敏度和特異度（分別為94%和86%），認(rèn)為其是一個(gè)有效的子宮頸癌前病變篩查的生物標(biāo)志物。

7 小結(jié)

篩查子宮頸癌前病變對(duì)于早期治療和預(yù)防子宮頸癌具有重要價(jià)值，尋找到一種或數(shù)種適宜的生物標(biāo)志物，優(yōu)化現(xiàn)有的篩查方法從而提高診斷的特異度和靈敏度，是目前的研究方向。盡管上述提到的生物標(biāo)志物在子宮頸癌病變不同階段有特異性的表達(dá)，能夠分辨出高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變，但要達(dá)到臨床應(yīng)用的要求，仍需要前瞻性的臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。