以興奮性毒性機(jī)制為靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)策略研究進(jìn)展

劉玉玉綜述，王 強(qiáng)審校

興奮性毒性是最早發(fā)現(xiàn)并被廣泛認(rèn)可的腦缺血卒中后損傷的分子機(jī)制之一，當(dāng)大腦處于缺血缺氧狀態(tài)，由于代謝障礙，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加與重?cái)z取出現(xiàn)障礙，最終導(dǎo)致大腦缺血區(qū)域興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的水平迅速升高[1]。隨后谷氨酸受體的激活導(dǎo)致鈣內(nèi)流和神經(jīng)元去極化，進(jìn)而導(dǎo)致大腦中許多鈣依賴通路的異常激活和壞死、凋亡和自噬過程的啟動[2]。研究表明由谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性是導(dǎo)致缺血性腦卒中、癲癇、阿爾茨海默病、精神疾病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)元損傷的重要作用機(jī)制[3]。自上世紀(jì)50年代興奮性毒性的概念提出以來，關(guān)于谷氨酸釋放、轉(zhuǎn)運(yùn)體功能改變、受體表達(dá)及其引起的下游細(xì)胞死亡信號的激活等已成為腦缺血損傷機(jī)制的研究重點(diǎn)。本文綜述了近幾十年以興奮性毒性機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)策略，并對新一代興奮性毒性抑制劑如何在上一代藥物失敗的情況下獲得成功進(jìn)行分析，以期為興奮性毒性機(jī)制的研究和神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)提供幫助。

1 谷氨酸受體及病理激活機(jī)制

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸受體包括離子依賴型和代謝型，根據(jù)選擇性激動劑，離子型谷氨酸受體可分為NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體、AMPA(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸)受體及KA(海人藻酸)受體[4]。代謝性谷氨酸受體主要是與G蛋白耦聯(lián)的受體。其中NMDA受體在缺血性腦損傷的發(fā)生機(jī)制中占據(jù)主要地位，是神經(jīng)保護(hù)類藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。

離子依賴型谷氨酸受體是配體門控通道中最具代表性的一類受體，它們具有細(xì)胞外谷氨酸結(jié)合位點(diǎn)和跨膜離子通道[5]。在靜息狀態(tài)下，NMDARs的通道空隙通常被Mg2+阻斷。當(dāng)谷氨酸從突觸前膜釋放后，激活的AMPAR導(dǎo)致突觸后膜的部分去極化，其足以清除阻滯在NMDAR離子通道中Mg2+，一旦NMDAR被激活，離子通道打開，細(xì)胞外的Na+和Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞[6]。在興奮性毒性中，過量釋放的谷氨酸導(dǎo)致NMDARs過度激活，Ca2+內(nèi)流增加，致使神經(jīng)元內(nèi)鈣超載。鈣超載可觸發(fā)一系列下游促死亡信號事件，如鈣蛋白酶激活、活性氧生成、線粒體損傷等，致使細(xì)胞壞死或凋亡[7]。

2 靶向NMDAR的藥物研究進(jìn)展

鑒于NMDAR在興奮性毒性的重要作用，最初的治療策略主要是阻斷受體。NMDAR上有許多藥理學(xué)上可以利用的位點(diǎn)，包括離子通道孔、谷氨酸結(jié)合位點(diǎn)、甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)等，NMDA受體拮抗劑主要通過靶向上述位點(diǎn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

根據(jù)藥物作用靶點(diǎn)的差異，谷氨酸受體拮抗劑可分成競爭性和非競爭性受體拮抗劑。非競爭性拮抗劑主要在通道空隙水平阻斷NMDAR，從而減少鈣的流入。鹽酸瑞馬西胺、鹽酸阿替加奈、MK-801(dizolcipine)、美金剛、dextromethorphan、及其代謝物dextrorphan等是近年來研發(fā)的非競爭性NMDA受體拮抗劑，它們在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)中都顯示出神經(jīng)保護(hù)作用，但遺憾的是，在隨后的臨床試驗(yàn)中，除美金剛外其他的藥物均未展現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。競爭性受體拮抗劑通過競爭性結(jié)合谷氨酸結(jié)合位點(diǎn)來抑制受體的過度激活。當(dāng)前研發(fā)的競爭性NMDA受體拮抗劑主要有賽福太和D-CPP-ene，研究表明這兩種藥物均可減輕神經(jīng)元損傷和降低梗死體積，但接下來的兩項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的死亡率增加，因此這兩種藥物在臨床也被暫停使用。

研究表明NMDAR需要甘氨酸(協(xié)同激動劑)協(xié)同激活[5]。在協(xié)同激動劑和激動劑都與受體上的位點(diǎn)結(jié)合后，選擇性陽離子通道打開，陽離子內(nèi)流(尤其是Na+、Ca2+、K+)[5]。甘氨酸位點(diǎn)競爭性拮抗劑Gavestinel和Licostinel，通過競爭性結(jié)合甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)，來抑制NMDA受體激活，與直接阻斷NMDA受體的藥物相比，Gavestinel和Licostinel的不良反應(yīng)更少。研究發(fā)現(xiàn)與許多NMDA受體拮抗劑相比，Licostinel可能是一種更安全、更耐受的神經(jīng)保護(hù)劑。但遺憾的是，諾華公司在發(fā)現(xiàn)一些患者的尿液中含有可能有害的Licostinel晶體后推遲了進(jìn)一步的研究。2005年，CoCensys終止了Licostinel的研發(fā)。Sacco等開展的多中心GAIN試驗(yàn)顯示在急性缺血性卒中后6 h內(nèi)使用gavestinel，與安慰劑組對比，實(shí)驗(yàn)組在3個月時(shí)神經(jīng)功能沒有改善，在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中，梗死面積(MRI)也無明顯差異[8]。

3 靶向NMDAR亞基的藥物研究

最近的研究表明NMDA受體在神經(jīng)元的存活和死亡中具有雙重作用，NMDARs的正常激活在突觸可塑性、大腦發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶等方面發(fā)揮重要作用，然而，當(dāng)NMDARs在病理狀態(tài)下被過度激活時(shí)，會引發(fā)神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[9]。NMDA 受體拮抗劑在治療劑量下，除抑制受體的異常激活，受體正常的生理活動也會受到影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、心血管和精神方面的影響等。因此，選擇性抑制受體過度激活而保留正常的受體活動成為藥物研究的新目標(biāo)。

NMDAR由兩個GluN1亞基和兩個GluN2亞基構(gòu)成的異質(zhì)四聚體。兩個GluN1亞基構(gòu)成了離子通道的主體結(jié)構(gòu)，NMDARs的主要特性由其決定，GluN2亞基在NMDAR功能中主要起調(diào)節(jié)NMDAR離子通道的作用[10]。GluN2亞基可以是GluN2A-GluN2D，也可以是GluN3A和GluN3B[11]。不同亞基構(gòu)成的NMDAR具有不同的作用，在腦內(nèi)的分布部位也有很大差異。最近的研究表明，NMDARs在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用可能取決于受體的亞細(xì)胞位置和亞型。在受體位置假說中，刺激突觸的NMDARs激活促生存信號通路，而突觸外NMDARs的激活與促死亡信號通路相關(guān)[12]。已證實(shí)GluN2A亞基主要存在于突觸內(nèi)，是谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)元存活所必須的，而突觸外位點(diǎn)則富含GluN2B受體，被認(rèn)為會導(dǎo)致興奮性毒性和細(xì)胞死亡。近年來，研發(fā)了選擇性抑制GluN2B的藥物，如艾芬地爾及其衍生物依利羅地(eliprodil)(SL-82.0715)和曲索羅地( traxoprodil) (CP-101,606)，這些藥物沒有傳統(tǒng)NMDAR拮抗劑的副作用。然而這些藥物用于臨床的有效性與安全性仍需更多的研究來證實(shí)。

4 干預(yù)NMDAR的下游死亡信號通路的治療策略

由不同的亞基組成的NMDARs在突觸與突觸外的分離并不是絕對的，因此選擇性抑制突觸外的含GluN2B的NMDARs仍有可能拮抗突觸含GluN2A的NMDARs。近年來，研究人員建議將NMDAR的下游死亡信號通路作為研究目標(biāo)，而不再局限于受體本身。這種方法主要針對下游的死亡信號通路而對NMDARs介導(dǎo)的正常生理過程沒有影響。

GluN2B-PSD95-nNOS通路是在與膜結(jié)合的NMDARs相關(guān)的多蛋白復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的一種特征明顯的神經(jīng)元死亡信號通路[6]。PSD95(突觸后蛋白密度為95KDa的支架蛋白)為NMDARs和包括nNOS(一氧化氮合酶)在內(nèi)的下游分子提供了一種結(jié)構(gòu)性連接[13]。當(dāng)NMDARs被過度激活時(shí)，內(nèi)流的Ca2+通過鈣調(diào)蛋白激活nNOS，從而產(chǎn)生過量的NO(一氧化氮)，NO是一種活性氮，能與自由基超氧化物相互作用形成過氧亞硝酸鹽，這是一種可導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝化和氧化、脂質(zhì)過氧化和直接DNA損傷的強(qiáng)氧化劑，過量產(chǎn)生的NO最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。破壞GluN2B-PSD95-nNOS復(fù)合物可以抑制NMDA介導(dǎo)的NO的生成，保護(hù)神經(jīng)元。抑制NO產(chǎn)生的一種方法是使用結(jié)合PSD95或nNOS的干擾肽，最近研發(fā)的被稱為Tat-NR2B9c或NA-1的干擾肽可將NMDARs與PSD95分離，并減弱下游神經(jīng)毒性信號[15]。在大鼠體內(nèi)進(jìn)行的研究表明，在缺血性卒中后給于NA-1可減少梗死面積，改善神經(jīng)行為功能[16]。一項(xiàng)在加拿大和美國14家醫(yī)院進(jìn)行的,用于評估NA-1用于人類缺血性腦損傷療效的一項(xiàng)雙盲、隨機(jī)、對照研究表明與對照組相比，NA-1治療組降低了梗死體積，且具有更好的預(yù)后效果[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)，ZL006和IC87201也可干擾GluN2B-PSD95-nNOS通路來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，然而它們在臨床使用的療效和安全性仍有待進(jìn)一步研究來證明。

抗氧化劑通過抑制NO介導(dǎo)的氧化和硝化應(yīng)激也可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，傳統(tǒng)的抗氧化劑，如依達(dá)拉奉、胞磷膽堿、替扎拉特等在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的薈萃分析中均顯示出神經(jīng)保護(hù)的效果。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)尿酸、褪黑素、EPO等非傳統(tǒng)抗氧化劑在多項(xiàng)臨床研究中也表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，但還需更多研究來證明其療效與安全性。

DAPK1(死亡相關(guān)蛋白激酶1)是一種依賴于Ca2+/鈣調(diào)蛋白的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性與細(xì)胞凋亡有關(guān)[18]。在正常狀況下，DAPK1的活性被自身磷酸化抑制，當(dāng)與Ca2+結(jié)合激活CaM后，DAPK1的抑制被解除，表現(xiàn)出促凋亡的活性[19]。在缺血性腦卒中中，過多的Ca2+流入細(xì)胞，激活CaM和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN),進(jìn)而使DAPK1脫磷和活化[20]。研究表明，活化的DAPK1在缺血損傷后被招募到NMDARs的GluN2B亞基[21]。最近研發(fā)的使DAPK1與GluN2B亞基解耦的干擾肽Tat-GluN2BCT1292-1304，在活體實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制與療效仍需更多的實(shí)驗(yàn)來證明[6]。腫瘤抑制因子P53是DAPK1的一種底物，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，控制缺血性卒中和神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞死亡途徑。一種干擾P53與DAPK1相互作用的干擾肽Tat-P53DM241-281已被Wang等證明在MACO后6 h給予可減少梗死體積，改善神經(jīng)行為[22]。

此外基于更下游死亡信號蛋白的研究，如Calpains(鈣激活酶)、MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)、SREBP1(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白)等也研發(fā)出一些藥物，這些藥物在體外和動物試驗(yàn)中都展示出神經(jīng)保護(hù)作用。

5 干預(yù)谷氨酸釋放和重?cái)z取的治療策略

除了干預(yù)NMDARs的下游死亡信號通路，干預(yù)谷氨酸釋放和重?cái)z取也是最近科學(xué)家研究的較多的神經(jīng)保護(hù)治療策略，這種治療策略從源頭解決NMDARs的過度激活，在一些研究中已經(jīng)表現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的潛能。

正常情況下，釋放到突觸間隙的谷氨酸會被谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體迅速清除，以保持突觸中谷氨酸平衡。在腦缺血、缺氧等的病理情況下，ATP的產(chǎn)生和利用出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致Na+/K+ATP酶功能障礙，K+在胞外堆積，使細(xì)胞去極化，Na+濃度梯度被破壞，轉(zhuǎn)運(yùn)體無法攝取胞外谷氨酸[23]，最終導(dǎo)致突出間隙谷氨酸過度堆積，產(chǎn)生興奮性毒性作用。

谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)有5種類型(EAAT1-EAAT5)，其中EAAT2負(fù)責(zé)腦內(nèi)大部分谷氨酸的清除，增強(qiáng)EAAT2活性或其在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)可能為抑制興奮性毒性提供一種新的治療方法[24]。研究發(fā)現(xiàn)，頭孢曲松能增加肌萎縮側(cè)索硬化癥小鼠模型中的EAAT2活性[25]，目前正在進(jìn)行這方面的臨床研究。此外有報(bào)道稱，具有復(fù)雜作用機(jī)制的利魯唑也能提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性[26]，但目前還沒有針對卒中或者創(chuàng)傷性腦損傷等的臨床試驗(yàn)。

研究表明，在大腦和血液之間創(chuàng)造一個更大的谷氨酸濃度梯度，可以提高谷氨酸從大腦流向血液的速度。因而使用血液谷氨酸清除劑，也可能具備潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。谷氨酸清除劑如草酰乙酸、丙酮酸、谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶已被證明可以降低血液中谷氨酸濃度，從而增加大腦對谷氨酸外排的驅(qū)動力，進(jìn)而降低大腦谷氨酸水平[27]。

6 思考及展望

盡管過去幾十年來以興奮性毒性機(jī)制為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)成指數(shù)式增長，但目前臨床上推薦用于卒中和多種神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護(hù)藥物屈指可數(shù)。這背后涉及多方面的原因，既有動物實(shí)驗(yàn)向臨床試驗(yàn)轉(zhuǎn)移的失敗，也有藥物嚴(yán)重的不良反應(yīng)導(dǎo)致的藥物研發(fā)的終止。但令人興奮的是，隨著分子生物學(xué)和藥理學(xué)進(jìn)展，我們對NMDA受體及其下游死亡信號通路和谷氨酸的清除機(jī)制有了更深的了解，針對這些新的治療靶點(diǎn)研發(fā)的藥物與傳統(tǒng)的NMDA受體拮抗劑相比，具有廣泛的治療時(shí)間窗和更少的不良反應(yīng)。然而針對這些新靶點(diǎn)的藥物多停留在動物實(shí)驗(yàn)階段，其臨床有效性與安全性還需臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

有研究指出興奮性毒性可通過多條死亡通路和多個靶點(diǎn)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，因此只針對單一靶點(diǎn)的藥物可能療效不佳，同時(shí)聯(lián)合針對多個靶點(diǎn)的藥物可能具有協(xié)同作用，因此針對多個靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)藥物也是未來研發(fā)的重要方向。